植入前遺傳學篩查用于幾種適應癥的效率初探

孫貽娟，曹英，張碩，伏靜，滕彬，谷瑞環，王寧怡，孫曉溪

(復旦大學婦產科醫院集愛遺傳與不育診療中心，上海 200011)

·專題討論·

植入前遺傳學篩查用于幾種適應癥的效率初探

孫貽娟，曹英，張碩，伏靜，滕彬，谷瑞環，王寧怡，孫曉溪*

(復旦大學婦產科醫院集愛遺傳與不育診療中心，上海 200011)

目的 探討植入前遺傳學篩查(PGS)用于染色體異常、反復種植失敗和反復自然流產患者的效率。 方法 回顧性研究2015年1月到2016年3月在我中心行PGS治療，共328個取卵周期和隨后進行的263個凍胚移植周期，根據其適應癥分為男方染色體異常(A組)、女方染色體異常(B組)、反復種植失敗(C組)和反復自然流產(D組)，分析4組患者的體外受精-胚胎發育情況、胚胎單核苷酸多態性(SNP)檢測分析結果和臨床結局。 結果 4組患者成熟卵母細胞(MII)率、受精率、卵裂率、D3有效胚胎率均無統計學差異(P>0.05)；獲卵數在A組(12.93±5.73)、B組(13.17±6.65)顯著高于C組(10.48±6.07)、D組(10.76±5.47)，D組可進行PGS活檢的胚胎數與D3有效胚胎數的比率(57.2%)顯著高于A組(51.3%)、B組(48.4%)和C組(50.0%)(P均<0.05)；正常核型胚胎比率C組(71.6%)、D組(58.7%)顯著高于A組(39.0%)、B組(33.5%)，而無可移植正常核型胚胎的周期率D組(13.5%)顯著低于A組(31.3%)、B組(33.3%)、C組(29.1%)(P均<0.05)；4組患者的妊娠率和流產率均無統計學差異(P>0.05)。 結論 三種適應癥的患者實施PGS均能達到滿意的臨床妊娠率；夫婦染色體異常的患者最終獲得正常核型胚胎的幾率較低，但是有效避免了高流產率的風險；反復自然流產的患者經PGS篩選后胚胎移植可將流產率控制在較低水平(3.4%)。

植入前遺傳學篩查； 反復種植失敗； 復發性流產； 單核苷酸多態性； 凍融胚胎移植

(JReprodMed2017，26(4)：308-312)

胚胎植入前遺傳學篩查(PGS)是指對體外受精獲得的具有遺傳風險或染色體非整倍風險的胚胎，在移植入子宮腔前行染色體結構和數目的檢測，分析是否有遺傳物質的異常，從而選擇正常胚胎進行移植。與針對攜帶已知遺傳性疾病患者的胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)不同，PGS用于存在高度胚胎非整倍體風險的夫婦，以提高體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的妊娠率，降低流產率。目前PGS的適應證在國內外尚無統一標準。本文通過對染色體異常、反復種植失敗和反復自然流產幾類患者應用PGS助孕的臨床結果分析，探討PGS用于這幾種適應癥的效率。

材料與方法

一、研究對象

回顧性研究2015年1月到2016年3月在復旦大學婦產科醫院集愛遺傳與不育診療中心行PGS治療共328個取卵周期和隨后進行的263個凍融胚胎移植(FET)周期。

PGS指證包括：(1)男女雙方的染色體異常，有或無自然流產史，經遺傳咨詢確定可行PGS；(2)反復種植失敗3次及以上，并且排除其他因素導致的反復種植失敗；(3)反復自然流產2次及以上，并排除夫婦染色體異常和其他導致流產的因素，或者流產史中明確胚胎異常，或有不良孕產史者。

所有PGS的患者都經遺傳咨詢并給予充分知情告知。根據PGS指證將其分為男方染色體異常組(A組)、女方染色體異常組(B組)、反復種植失敗組(C組)和反復自然流產組(D組)。

二、方法

1.控制性超促排卵：根據患者年齡和卵巢儲備功能，采用我中心常規的GnRH-a/FSH/HMG長方案或GnRH-ant/FSH/HMG拮抗劑方案或克羅米芬/HMG微刺激方案。根據B超監測和血清E2水平適當調整藥物劑量，當2個以上主導卵泡直徑達18 mm時給予HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U，34～36 h后經陰道B超引導下穿刺取卵。

2.體外受精胚胎培養與胚胎評價：所有擬行PGS檢測的周期常規行卵胞漿內單精子注射(ICSI)授精，授精后16～18 h觀察受精情況，選出正常受精(2PN)的合子，繼續培養并記錄D3胚胎發育情況，包括胚胎卵裂球數目、大小均一性和碎片程度，根據我中心常規分級方法將胚胎分為I～IV級[1]。胚胎數目在6細胞以上、分級在III級以上者判定為D3日可用胚胎，可用胚胎行激光透明帶打孔后繼續培養至D5。D5根據囊胚發育分期、內細胞團和滋養層分級對囊胚進行評分[2]：囊胚發育分期評分為I～V期，內細胞團評分A～C級，滋養層評分A～C級。D5未發育到IV期的囊胚再繼續培養一天至D6再次評估，標準同D5。

3.囊胚活檢與玻璃化冷凍：選擇分期在V期以上且分級在BC、CB以上的囊胚行活檢，將活檢胚胎置于顯微操作皿中，顯微固定針固定囊胚，使孵出的細胞與囊胚“赤道面”在一個平面上，活檢針輕輕吸住孵出的滋養層細胞回拉，同時激光切割4～5個滋養層細胞，將活檢取得的細胞放入細胞裂解液待檢測。囊胚立即采用Cryotop進行玻璃化冷凍，使用歐文公司的冷凍試劑盒(Irvine Scientific，美國)：首先將囊胚室溫下轉移至ES液中平衡7 min，然后轉移至VS液中多點沖洗平衡，迅速將囊胚放到Cryotop前端浸入液氮，囊胚從進入VS液至進入液氮的時間控制在45～60 s。

4.單核苷酸多態性(SNP)檢測：獲取的胚胎滋養層細胞應用QIAGEN REPLI-g Single Cell Kit試劑盒(Qiagen，德國)，按照試劑盒標準實驗步驟進行全基因組擴增(whole-genome amplification，WGA)，簡述如下：4 μl樣品，3 μl buffer D2混勻后，65℃孵育10 min后，加入3 μl終止液；隨后每個反應加入40 μl Master mix，使總反應體系達到50 μl，30℃孵育8 h，65℃ 3 min后4℃保存。隨后按照Illumina Cyto-12芯片(Illumina，美國)實驗步驟進行第二輪擴增、DNA片段化、沉淀、重懸、芯片雜交、洗滌、SNP單堿基延伸、著色等，應用Illumina iScan進行芯片掃描，應用Karyotype和Bluefuse Multi軟件對芯片掃描數據進行胚胎染色體的拷貝數變異分析。通過LogR比率分析判斷胚胎染色體的拷貝數變異：當LogR為0時，說明檢測位點為正常拷貝數2；若升高，則說明拷貝數大于2；反之則小于2[3]。

5.囊胚復蘇與胚胎移植：PGS檢測結果正常的胚胎擇期進行囊胚復蘇與胚胎移植。囊胚于移植當天上午復蘇：使用歐文公司的解凍試劑盒(Irvine Scientific，美國)，將載有胚胎的Cryotop從液氮中取出，迅速將前端浸入預熱好的37℃ TS液中，胚胎自載體上自動脫落，平衡1 min后，依次移入常溫下的DS、WS1、WS2各3 min，最后放入囊胚培養液中，培養2 h后移植。

內膜準備：患者自然周期排卵后或人工周期血

清E2達到734 pmol/L、內膜達7 mm后開始注射黃體酮，注射黃體酮第6天行凍胚復蘇移植。

6.妊娠結局確定：移植后14 d測血β-HCG，陽性者2周后B超檢查探及宮內孕囊及胎心搏動為臨床妊娠。

三、統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料用(均數±標準差)(±s)表示，組間均數比較采用t檢驗、方差分析，率之間比較采用χ2檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、患者一般情況

由于4組患者PGS指證不同，C組和D組的年齡顯著大于A、B組，C組移植失敗次數顯著高于其他3組，D組流產次數顯著高于其他3組(P均<0.05)(表1)。

表1 四組患者一般情況(x-±s)

注：與A、B組比較，*P<0.05；與其他3組比較，#P<0.05

二、體外受精-胚胎發育相關數據

4組患者成熟卵母細胞(MII)率、正常受精率、卵裂率、D3有效胚胎率均無統計學差異(P>0.05)；A、B組獲卵數顯著高于其他兩組(P<0.05)，D組可進行PGS活檢的胚胎數與D3有效胚胎的比率顯著高于其他3組(P<0.05)(表2)。

表2 四組患者體外受精胚胎發育情況[(x-±s)，%]

注：與C、D組比較，*P<0.05；與其他3組比較，#P<0.05

三、SNP檢測結果與FET結局

C、D組正常胚胎比率顯著高于其他兩組(P<0.05)；D組無正常胚胎移植的周期率顯著低于其他3組(P<0.05)；四組的妊娠率均在50%以上，流產率均在10%以下，組間無統計學差異(P>0.05)(表3)。

表3 四組患者SNP檢測結果與FET結局(n，%)

注：與A、B組對比，*P<0.05；與其他組對比，#P<0.05

討 論

近十余年，PGS在歐美發達國家的輔助生育領域中已大量應用，被用于高齡女性、反復種植失敗、反復流產患者和嚴重男性因素的不育患者，其中高齡占總PGS數的50%左右[4]，應用PGS選擇染色體數目正常的胚胎移植可以提高種植率和妊娠率，降低流產率，提高活產率[5]，高齡女性卵母細胞非整倍體率增加，曾被認為是PGS的最大受益者。另外對于預后良好的女性，有研究者認為通過PGS選擇優質胚胎進行單胚胎移植可以降低醫源性多胎妊娠帶來的風險[6]。由此PGS曾一度得到越來越廣泛的應用，根據歐洲人類生殖與胚胎協會(ESHRE)收集的多中心數據，2006年全球57個生殖中心共進行了3 900個PGS周期[7]。

但是關于PGS應用指征的爭論從未停止。荷蘭學者Mastenbroek等[8]通過一個大樣本、多中心、隨機 雙盲研究，發現408名年齡35～41歲的IVF婦女中，取單卵裂球活檢進行PGS反而明顯降低了活產率而流產率相似，說明PGS對于高齡婦女只是干擾了胚胎的自然選擇，對妊娠結局并無益處。另外一項對PGS研究的Meta分析也表明行PGS會顯著降低高齡婦女的活產率[9]。ESHRE的PGD組織對2010年PGS的統計數據表明，參與調查的全球62個生殖中心進行了2 979個PGS周期，PGS的常規應用呈下降趨勢[10]。目前認為PGS的應用仍然應以治療為目的，需要篩選指證。

本中心的PGS指證包括本研究中的男女雙方染色體異常、反復種植失敗與反復自然流產。父母染色體異常是導致自發性流產的原因之一，其中任何一方的染色體平衡易位是最重要的原因，曾經有過異常胚胎核型的夫婦再次妊娠發生胚胎異常的概率比前次妊娠胚胎核型正常的夫婦高[11]。本研究中將男、女染色體異常患者分為兩組分別統計，結果顯示兩組患者一般情況、體外受精-胚胎發育相關數據、PGS檢測結果和FET臨床結局等數據均無統計學差異，這部分患者是流產后常規檢查發現一方染色體異常或是由于不孕來就診篩查時發現染色體異常而轉入PGS周期，所以年齡低于反復種植失敗組和反復自然流產組的患者，而其移植失敗次數與流產次數并無顯著增高，體外受精-胚胎發育數據與反復種植失敗組和反復自然流產組及本中心非PGS周期的平均數據均無顯著差異，而正常胚胎比率顯著低于其他兩組，也說明胚胎質量和其攜帶染色體正常與否沒有明顯關系，兩組患者都獲得50%以上的臨床妊娠率，流產率低于10%。

ESHRE PGD組織將反復種植失敗定義為：3次移植高質量胚胎或者多次移植胚胎總和≥10枚，在移植5周以后B超下未探及胎囊[12]。胚胎染色體異常被認為是IVF反復種植失敗的原因之一，而胚胎染色體異常在多大程度上影響植入前胚胎的形態目前仍然未知[13]。配子減數分裂過程中和卵母細胞受精后均可產生非整倍體，胚胎分裂時期產生的染色體異常絕大多數發生在前3次有絲分裂，產生嵌合體[14]。這是通過PGS選擇正常胚胎移植來改善這部分患者妊娠結局的主要理論依據[4]。Greco等[15]的研究結果表明：反復種植失敗的患者在進行PGS篩選胚胎后獲得與非反復種植失敗的PGS周期患者相同的臨床妊娠率和著床率，而未行PGS的反復種植失敗患者的臨床妊娠率遠遠低于行PGS后的反復種植失敗患者。本研究中反復種植失敗患者體外受精-胚胎發育數據均與本中心非PGS周期的平均數據一致，正常胚胎比率顯著高于染色體異常的患者，但是無正常胚胎可移植的周期比率與染色體異常患者是相似的，說明這部分患者中有部分反復種植失敗與胚胎異常有關。本組FET的結局也是令人滿意的，說明PGS技術對于反復種植失敗的患者是有效的。

反復自然流產原因復雜，在排除了子宮異常、夫婦染色體異常和免疫性因素外，仍然有大約一半的患者被定義為不明原因反復自然流產，而胚胎染色體的異常經常是其原因，PGS是降低這部分患者流產率的有效辦法[16-17]。而Murugappan等[18]對PGS的成本-獲益分析表明：PGS與期待療法相比并不是經濟有效的方式，IVF/PGS的活產率需達到91%才可與期待療法相當。但是對于反復自然流產或者有過不良生育史的女性來說，再次流產對身心都是巨大的傷害，PGS仍然是個好的選擇。本研究中這一組患者的PGS胚胎數/D3有效胚胎數的比率顯著高于其他指證的患者，而正常胚胎比率顯著高于染色體異常組，無正常胚胎周期率顯著低于其他3組患者，說明反復流產患者無論從胚胎質量還是胚胎染色體都優于其他兩類患者，妊娠率也為最高(但由于例數較少，未見統計學差異)，而流產率也同樣控制在比較低的水平(3.4%)。

本研究結果證明，染色體異常、反復種植失敗和反復自然流產患者實施PGS均能達到滿意的治療效果，減少流產概率，減少無效移植次數，更快地成功妊娠。我們仍然需要進一步明確哪些患者可以從PGS技術最大獲益，實施PGS的效率如何仍然需要更多更大樣本的研究。

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[編輯：羅宏志]

Efficiency of preimplantation genetic screening in applying to different indications

SUNYi-juan，CAOYing，ZHANGShuo，FUJing，TENGBin，GURui-huan，WANGNing-yi，SUNXiao-xi*

JiAiGenetics&IVFInstitute，Obstetrics&GynecologyHospital，FudanUniversity，Shanghai200011

Objective：To explore the efficiency of preimplantation genetic screening (PGS)in applying to the patients with chromosome abnormality，recurrent implantation failure (RIF)，and recurrent spontaneous abortion (RSA).Methods：A total of 328 PGS treatment cycles and 263 subsequent frozen embryo transfer (FET) cycles in our reproductive center from Jan. 2015 to Mar. 2016 were included in this study. The patients were divided into four groups according to different indications：group A with patients of husband’s chromosome abnormality，group B with patients of wife’s chromosome abnormality，group C with patients of RIF，and group D with patients of RSA. The basic information，the clinical outcomes including in vitro fertilization and embryo development，single nucleotide polymorphism (SNP) results and clinical outcome of FET cycles were analyzed among the four groups.Results：There were no differences in oocyte MII rate，fertilization rate，cleavage rate，usable embryo rate on Day 3 among the four groups (P>0.05). The number of oocytes retrieved in group A (12.93±5.73) or in group B (13.17±6.65) were significantly higher than that in group C (10.48±6.07) or group D (10.76±5.47). The ratio of the number of blastocysts available for PGS and the number of usable embryos on Day 3 in group D (57.2%) was significantly higher than that in group A (51.3%)，group B (48.4%) or group C (50.0%) (allP<0.05). The rates of normal karyotype embryo in group C (71.6%) and group D (58.7%) were significantly higher than that of group A (39.0%) and group B (33.5%). The rate of cycles with no normal karyotype embryos for transplantation in group D (13.5%) was significantly lower than that in group A (31.3%)，group B (33.3%) or group C (29.1%) (allP<0.05). The clinical outcomes including clinical pregnancy rate and abortion rate were not significantly different among the four groups (P>0.05).Conclusions：The patients with the three different indications can get satisfactory clinical outcomes by PGS. The couples with chromosome abnormality have lower probability to obtain normal karyotype embryos，but are effective in avoiding the risk of high abortion rate. The abortion rate of patients with RSA can be controlled at a low level (3.4%) by means of PGS technique.

Preimplantation genetic screening； Recurrent implantation failure； Recurrent spontaneous abortion； Single nucleotide polymorphism； Frozen embryo transfer

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.003

2017-02-09；

2017-02-27

孫貽娟，女，山東萊蕪人，博士，副主任醫師，生殖醫學專業.(*

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