CRM197對人乳腺癌細胞侵襲及轉移的抑制作用及機制

梁秋實，胡 宜（中國醫科大學附屬盛京醫院：超聲科，神經外科，遼寧 沈陽0004）

CRM197對人乳腺癌細胞侵襲及轉移的抑制作用及機制

梁秋實1，胡 宜2（中國醫科大學附屬盛京醫院：1超聲科，2神經外科，遼寧 沈陽110004）

目的：研究CRM197對人乳腺癌細胞侵襲、轉移能力以及對基質金屬鐵蛋白酶?2、9活性和磷酸化Akt表達的影響．方法：將濃度為10 μg／mL的CRM197孵育MDA?MB?231人乳腺癌細胞24 h．利用Transwell小室建立體外遷移及侵襲模型，觀察CRM197對MDA?MB?231細胞遷移及侵襲能力的影響．利用明膠酶譜分析方法檢測CRM197對MDA?MB?231細胞的基質金屬鐵蛋白酶?2、9活性改變情況．最后利用West?ern blot方法分析CRM197對MDA?MB?231細胞的磷酸化Akt表達水平的影響．結果：在10 μg／mL的 CRM197處理下，MDA?MB?231人乳腺癌細胞的侵襲和轉移能力明顯降低，同時基質金屬鐵蛋白酶?2、9活性以及磷酸化Akt的表達水平受到顯著抑制．結論：CRM197能夠通過抑制基質金屬鐵蛋白酶?2和9的活性而減弱人乳腺癌細胞的體外侵襲及遷移特性，并且在這一過程中PI3K／Akt信號通路發揮作用．

CRM197；乳腺癌；侵襲；遷移；基質金屬鐵蛋白酶；Akt

0 引言

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的常見惡性腫瘤，是第二位導致死亡的婦科惡性腫瘤［1］．傳統治療方法是手術切除．但因乳腺癌具有侵襲及浸潤的生長方式，往往具有衛星病灶及亞臨床病灶，并且存在早期轉移的特性，手術全切困難，并且極易復發．乳腺癌的重要生物學特性是侵襲及遷移，是該惡性腫瘤浸潤生長并容易發生早期轉移的重要原因［2］．目前手術后輔助放化療已成為常規，但對乳腺癌的作用有限，并且往往具有較嚴重的全身并發癥［3］．因此在乳腺癌的治療中，開發效果更好、副作用更少的新型治療藥物十分重要．

交叉反應物質?197（cross?reactive materials 197，CRM197）是一種失活、無毒性的白喉毒素變異體，能與細胞膜上特定的白喉毒素受體（diphtheria toxin receptor，DTR）結合而發揮疫苗載體的作用［4］．研究發現CRM197能夠抑制肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤［5－7］．然而，CRM197在乳腺癌中的治療作用及機制仍不明確．

在本研究中，首先觀察CRM197對MDA?MB?231人乳腺癌細胞侵襲及遷移兩種特性的影響，并通過調查其對金屬鐵蛋白酶?2（MMP?2）、金屬鐵蛋白酶?9（MMP?9）及下游磷酸化Akt（p?Akt）的作用初步探討CRM197對人乳腺癌惡性生物學行為的作用以及機制．

1 材料和方法

1．1 MDA?MB?231細胞株的體外培養乳腺癌MDA?MB?231細胞株購自中國醫科大學的實驗中心．在含有10%胎牛血清（FBS）（天津灝洋生物技術有限公司）的DMEM?F12培養基（Hyclone，USA）中培養，培養環境為37℃、含5%CO2的恒溫培養箱．

1．2 體外遷移模型的建立體外遷移模型的建立方法將具有聚碳酸酯膜的孔徑為8 μm的Transwell小室（購自Coning Costar公司）放置在24孔板的孔中．首先利用0．25%胰蛋白酶消化處于80%融合的MDA?MB?231細胞，以無血清DNEM?F12培養基重懸胰酶消化的細胞，倒置顯微鏡下計數，將細胞密度為4×104／mL的細胞懸液200 μL接種于Transwell上室中，24孔板孔內置600 μL含10%FBS的DMEM?F12培養基．根據文獻，CRM197在研究中的常用濃度為1～100 μg／mL［8］．在之前針對腦惡性腫瘤的研究中發現，10 μg／mL的CRM197能夠明顯抑制腫瘤細胞［9］．因此在本研究中，采用10 μg／mL作為CRM197的實驗劑量．培養4 h，待細胞貼壁后實驗組加入CRM197（10 μg／mL）．對照組的24孔板小孔內Transwell小室放置同樣細胞密度及體積懸液，但不加入CRM197．培養24 h后，將Transwell小室取出，以無菌棉棒輕柔的去除半透膜上表面殘留的MDA?MB?231細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution：PBS）洗3次，然后利用甲醇和冰乙酸混合液（3∶1比例）固定30 min，根據Giemsa法染色15 min．輕輕甩掉染液，蒸餾水沖洗3次，在倒置顯微鏡下計數遷移到半透膜下表面的MDA?MB?231細胞數量．每組6孔，每孔隨機計數6個200×視野內的細胞數，最后進行統計學分析．

1．3 體外侵襲模型的構建體外侵襲模型的建立方法同樣采用8 μm孔徑的Transwell小室及24孔板．與遷移模型不同的是，將Matrigel基質膠（美國BD公司）與DMEM?F12培養液按1∶7的比例稀釋后，鋪于Transwell小室聚碳酸酯膜的上表面，在無菌超凈臺內通風干燥．按照方法1．2中敘述，消化MDA?MB?231細胞后接種在Transwell上室之中．實驗分組及處理方法同方法1．2所述．培養24 h后，取出Transwell小室，輕輕擦去膜上表面的殘留細胞，Giemsa法固定染色，倒置顯微鏡下計數并統計學分析．

1．4 Western blot法測MMP?2、MMP?9及p?Akt的蛋白表達生長狀態達到80%融合的MDA?MB?231細胞分為實驗組和對照組．前者在培養體系中以濃度為10 μg／mL的CRM197處理24 h，對照組則不加入CRM197．首先用預先冰冷的PBS洗3次，細胞收集于離心管中，用RIPA裂解液（碧云天）在冰上裂解30 min，然后超聲粉碎．在4°C溫度下以15 000 g的離心力離心10 min，將蛋白上清液收集到新離心管中．利用BCA試劑盒（碧云天），以牛血清白蛋白為標準測定收集到的上清液的蛋白濃度．蛋白分離采用10%SDS?polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）凝膠電泳，每孔內的蛋白上樣定量為25 μg．轉膜后以兔抗人MMP?2、MMP?9多克隆抗體和小鼠抗人β?actin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）封閉過夜．按1∶5000比例稀釋辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗（中山金橋生物技術公司），在室溫下孵育2 h．根據ChemiImager 5500 V2．03軟件測定并計算MMP?2、MMP?9及p?Akt與β?actin的相對積分光密度比值并進行數學統計分析．

1．5 明膠酶譜分析MMP活性MDA?MB?231細胞的MMP?2和MMP?9的活性變化以明膠酶譜方法檢測．分組方法及處理因素同方法1．4．根據說明書，酶譜分析利用含有0．1%明膠的 SDS?聚丙烯酰胺（Invitrogen，美國）．樣品條帶放置在含有0．1%Coo?massie R?250、40%乙醇及10%乙酸的溶液中，室溫下固定30 min，然后在10%乙醇及7．5%乙酸的溶液中進行脫色2 h．最后利用Chemi Imager 5500 V2．03軟件檢測條帶的光密度并進行統計學分析．

1．6 統計學處理采用SPSS13．0統計學軟件進行數據分析．組間差異以±s表示，并經過配對t檢驗驗證，以P＜0．05為差異具有統計學意義．

2 結果

2．1 CRM197對MDA?MB?231細胞遷移能力的影響本研究中，利用Transwell體外遷移模型實驗觀察CRM197對MDA?MB?231人乳腺癌細胞遷移能力的作用．與對照組相比，CRM197作用24 h后，轉移到Transwell小室半透膜下表面的MDA?MB?231細胞的數量下降，差異有統計學意義（P＜0．05，圖1A），意味著遷移能力受到顯著抑制．

圖1 CRM197對MDA?MB?231乳腺癌細胞遷移及侵襲能力的影響

2．2 CRM197對MDA?MB?231細胞侵襲能力的作用利用 Transwell基質膠體外侵襲模型觀察CRM197對MDA?MB?231細胞侵襲的作用．與對照組相比，加入10 μg／mL的CRM197的實驗組中穿過Transwell基質膠半透膜到達下表面的細胞數量顯著降低，說明CRM197顯著抑制了人乳腺癌細胞的體外侵襲能力，差異有統計學意義（P＜0．01，圖1C）．

2．3 CRM197對MDA?MB?231細胞的MMP?2、MMP?9水解酶活性的作用MMP?2與MMP?9是在乳腺癌細胞降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM）而發生轉移的過程中重要的兩種蛋白酶，是乳腺癌惡性生物學行為相關的關鍵酶［10－11］．利用明膠酶譜分析方法進行酶動力性分析，結果顯示與對照組相比，在 CRM197的處理下 MDA?MB?231細胞的MMP?2和MMP?9降解明膠中的底物蛋白的能力明顯減弱（圖2）．上述結果表明CRM197能夠顯著的抑制人乳腺癌細胞MMP酶的表達水平與水解酶活性．

圖2 CRM197對MDA?MB?231乳腺癌細胞MMP?2和MMP?9酶活性的影響

2．4 CRM197對MDA?MB?231細胞p?Akt蛋白表達將CRM197作用于MDA?MB?231細胞24 h后，以Western Blot法調查MDA?MB?231細胞的磷酸化 Akt（p?Akt）的蛋白表達水平．與對照組相比，CRM197作用后MDA?MB?231細胞的p?Akt蛋白表達水平受到顯著的抑制（P＜0．01，圖3）．

圖3 CRM197對MDA?MB?231乳腺癌細胞p?Akt表達水平的影響

3 討論

乳腺癌的生長方式為浸潤性生長，極容易發生局部或遠隔轉移，發生早期轉移的病例約占全部患者的20%［12］．其治療方法已經由傳統的手術切除轉向綜合治療［13－15］．乳腺癌極容易發生早期轉移的生物學基礎是其具有遷移和侵襲特性［16］．因此能夠抑制乳腺癌細胞的遷移及侵襲能力的治療有助于控制乳腺癌的發展并改善患者的預后．CRM197是交叉反應物質家族中最重要的成員，能夠結合并抑制肝素結合性表皮生長因子樣生長因子（heparin?binding epidermal growth factor?like growth factor：HB?EGF）［4，17］．HB?EGF能夠介導多種惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移［18?19］．同時HB?EGF還表達于人乳腺癌細胞，參與其惡性行為的調控［20］．作為HB?EGF的抑制物質，CRM197能夠發揮抑制腫瘤的作用，如CRM197能夠抑制腎上腺皮質癌、卵巢癌、進展期胃癌等惡性腫瘤［5，21－22］．然而，CRM197對人乳腺癌細胞轉移及侵襲惡性的作用和機制尚不清楚．根據文獻報道，10 μg／mL的CRM197能夠明顯抑制腦惡性腫瘤、人舌鱗癌細胞、肺癌細胞和肝癌細胞［9，23］．因此在本研究中，利用10 μg／mL的CRM197作用于人乳腺癌細胞，結果顯示CRM197顯著抑制人乳腺癌細胞的侵襲及轉移能力．以上結果顯示CRM197有望成為新的乳腺癌的治療藥物．

細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是腫瘤外部的屏障，惡性腫瘤發生浸潤轉移必須降解ECM．基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是降解ECM的重要蛋白酶．人乳腺癌組織高度表達MMP?2和MMP?9［10－11］．研究結果顯示這兩種基質金屬蛋白酶受到抑制后，乳腺癌的轉移能力明顯下降［24］．本研究發現CRM197能夠抑制MDA?MB?231乳腺癌細胞的MMP?2、9的表達與活性，表明降低基質金屬蛋白酶活性，抑制其降解細胞外基質是CRM197遏制乳腺癌細胞遷移和侵襲的內在機制．磷脂酰肌醇?3?激酶（phosphoinositide?3?kinase，PI3K）通路是與細胞生命活動密切相關的重要信號傳導通路［25］．阻滯該通路可抑制乳腺癌細胞的增殖［26］．Akt蛋白是PI3K信號通路中重要的信號傳導蛋白，PI3K信號通路的激活依賴于Akt磷酸化［27］．研究表明HB?EGF能夠誘導Akt的磷酸化而使其活化［28?29］．因此推測CRM197的作用可能與Akt磷酸化水平改變有關．本研究的結果顯示，CRM197能夠明顯下調MDA?MB?231細胞的磷酸化Akt的表達．相關研究證實PI3K信號通路參與調控MMP?2及MMP?9的表達［30］．匯總上述結果可以認為CRM197是通過抑制乳腺癌細胞PI3K／Akt信號通路而發揮抗腫瘤作用的．

綜上所述，本研究發現CRM197能夠通過抑制乳腺癌細胞的MMP?2和MMP?9的蛋白酶的表達與活性而明顯降低乳腺癌細胞的侵襲和轉移能力，該抑制作用可能通過抑制乳腺癌細胞的Akt信號通路而實現．本研究的結果揭示了CRM197在乳腺癌瘤治療中的潛在價值，并為其應用于臨床提供了實驗依據．

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Theinhibitoryeffectsand mechanism of CRM197 on the migration and invasion of human breast cancer cells

LIANG Qiu?Shi1，HU Yi2
Shengjing Hospital of China Medical University：1Department of Ultrasound，2Department of Neurosurgery，Shenyang 110004，China

AIM：To investigate the effects of CRM197 on the migration，invasiveness，the activity of matrix metalloproteinase?2，9 as well as the expression of phosphorylated Akt of human glioma cells．METHODS：MDA?MB?231 human breast cancer cells were treated with 10 μg／mL CRM197 for 24 h．Cellular migration and invasiveness were assessed with Transwell assays．Zymography assay was performed to check the enzymatic activity of matrix metalloproteinase?2 and 9．Western blos assay was carried out to investigate the expression of phosphorylated Akt．RESULTS：Under the treatment of 10 μg／mL CRM197，the migration and invasion of MDA?MB?231 human breast cancer cells reduced significantly．The activity of matrix metalloproteinase?2／9 and expression of phosphorylated Akt were inhibited significantly as well．CONCLUSION：CRM197 possibly inhibite the migration and invasiveness of human glioma cells through inhibiting the activity of matrix metalloproteinase?2 and 9，and PI3K／Akt path?way may be involved in the process．

CRM197；breast cancer；invasion；migration；matrix metalloproteinase；Akt

R737．9

A

2095?6894（2017）02?26?04

2016－12－06；接受日期：2016－12－20

國家自然科學基金（81302191）

梁秋實．E?mail：18940259861＠163．com

胡 宜．副主任醫師，副教授．E?mail：hooyie＠hotmail．com