TNF-α對大鼠腎髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平蛋白表達的影響

隋洪玉，李 瑩，齊淑芳，賈秀月，趙曉蓮*

(1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154007)

TNF-α對大鼠腎髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平蛋白表達的影響

隋洪玉1，李 瑩2，齊淑芳1，賈秀月1，趙曉蓮1*

(1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：探討腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)對大鼠腎髓袢升支粗段中PKA(蛋白激酶A)及其磷酸化水平蛋白表達的影響。方法：在髓袢升支粗段組織中加入10nM的TNF-α作用5min，采用免疫印跡技術觀察TNF-α對PKA及其磷酸化水平蛋白表達的影響。結果：TNF-α未能明顯改變大鼠腎髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平的蛋白表達(P﹥0.05)。結論：TNF-α不能改變PKA的蛋白合成及其磷酸化水平的表達。

TNF-α；髓袢升支粗段；PKA

0 引言

腫瘤壞死因子是一種具有多種生物活性的細胞因子，包括TNF-α及TNF-β兩類。TNF-α主要由活化的單核細胞、巨噬細胞產生，也可在中性粒細胞、內皮細胞、平滑肌細胞中產生。在腎臟，TNF-α主要是由系膜細胞、近曲小管及髓袢升支粗段上皮細胞產生。大量文獻表明，TNF-α與糖尿病腎病的發生發展密切相關，其被稱為是糖尿病腎病發生的重要媒介物[1]。Keith DiPetrillo[2]等研究發現，糖尿病腎病大鼠早期即可出現尿TNF-α含量增高，及由TNF-α誘導的鈉潴留，并證明TNF-α主要是通過增加腎遠端小管鈉轉運導致鈉潴留發生的。但TNF-α是如何增加鈉重吸收進而導致鈉潴留的機制不明。本實驗以TNF-α為施加因素觀察了其對髓袢升支粗段組織中PKA及其磷酸化水平蛋白表達的影響，以探討PKA依賴途徑是否參與了TNF-α致腎小管鈉潴留的形成過程。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SD(Sprague-Dawley)大鼠，體重180～220g，雌雄均可。由哈爾濱醫科大學第二附屬醫院實驗動物中心提供。

1.2 藥品及溶液

TNF-α購于Sigma公司，PKA及p-PKA購于Santa Cruz公司。細胞外液(mmol/L)：140NaCl、5KCl、1.8CaCl2、1.8MgCl2、10HEPES(pH7.4)。

1.3 實驗方法和指標測定

1.3.1 藥品的配制

TNF-α先溶于去離子水中，再用細胞外液稀釋成相應濃度的藥液，4℃貯存備用。PKA、p-PKA、β-actin抗體用3%牛血清白蛋白(BSA)配制成實驗所需濃度，二抗用5%脫脂奶粉配制成相應濃度，4℃或-20℃貯存備用。

1.3.2 免疫印跡技術

取50μg蛋白樣品上樣，進行SDS-PAGE電泳，電泳至溴酚蘭到達分離膠底部后停止，取出凝膠，將含有目的蛋白的凝膠進行轉膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉目的蛋白1小時，繼而孵育一抗及二抗，最后進行ECL顯影、凝膠成像分析系統處理分析。

1.4 統計學處理

實驗數據以均數±標準差表示。給藥前后各項指標采用自身配對t檢驗，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 TNF-α對大鼠腎髓袢升支粗段組織中PKA蛋白表達的影響

在髓袢升支粗段組織中加入10nmol/L的TNF-α，作用5分鐘后，觀察其對PKA蛋白表達的影響。結果顯示，10nmol/L的TNF-α不能明顯改變PKA的蛋白表達(n=3，P>0.05)(見圖1，圖2)。

圖1 TNF-α(10nmol/L)對髓袢升支粗段PKA蛋白表達的影響

圖2 TNF-α(10nmol/L)對髓袢升支粗段PKA蛋白表達的影響

2.2 TNF-α對大鼠腎髓袢升支粗段組織中磷酸化PKA蛋白表達的影響

在髓袢升支粗段組織中加入10nmol/L的TNF-α，作用5分鐘后，觀察其對PKA蛋白表達的影響。結果顯示，10nmol/L的TNF-α不能明顯改變PKA的蛋白表達(n=3，P>0.05)(見圖3，圖4)。

圖3 TNF-α(10nmol/L)對髓袢升支粗段PKA磷酸化水平的影響

圖4 TNF-α(10nmol/L)對髓袢升支粗段PKA磷酸化水平的影響

3 討論

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常見的并發癥，是糖尿病患者的主要死因之一。DN的病理變化主要表現為腎臟肥大，腎小球和腎小管基膜增厚、胞外基質積聚及腎小球硬化等。而糖尿病腎病早期的病理變化主要表現為鈉潴留，是導致高血壓和腎臟肥大的原因。因高血壓和腎臟肥大在糖尿病腎病患者中經常被觀察到，故鈉潴留可看作是糖尿病腎病早期腎功能改變的一個重要指標[3]。研究發現，由鈉潴留導致的腎臟肥大主要發生在腎小管，且遠端小管的改變先于近端小管。另外，近年來大量研究表明，尿TNF-α含量升高是DN早期形成的重要標志，且其含量與DN的嚴重程度呈正相關[4,5]。Keith DiPetrillo等證實，糖尿病腎病大鼠早期出現的尿TNF-α含量增高所致的鈉潴留是通過增加腎遠端小管鈉轉運而造成的，但TNF-α是如何增加鈉轉運進而導致鈉潴留的機制不明。此外，由于腎遠端小管對鈉的轉運主要發生在髓袢升支粗段，因此，本實驗觀察了TNF-α對髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平蛋白表達的影響，以探討PKA依賴途徑是否參與了TNF-α致腎小管鈉潴留的形成過程。實驗結果顯示，TNF-α未能明顯改變大鼠腎髓袢升支粗段中PKA及其磷酸化水平的蛋白表達，說明TNF-α導致腎小管鈉潴留可能不是通過PKA依賴途徑發生的。

4 結語

但PKA蛋白合成是需要一段時間完成的，而本實驗中施加因素作用的時間比較短，可能還未達到PKA總蛋白含量改變的時限，只能說明TNF-α不是通過改變PKA磷酸化水平導致腎小管鈉潴留發生的。因此，在今后的實驗中可以利用糖尿病模型進一步探討PKA總蛋白含量是否發生改變，以確定PKA途徑是否介導了腎小管鈉潴留的發生。

[1]Fernández-Real JM, Vendrell J, García I, et al.StructuraldamageindiabeticnephropathyisassociatedwithTNF-αsystemactivity. Acta Diabetol 49(4): 301-305, 2012.

[2]Dipetrillo K, Coutermarsh Bonita, Gesek FA.Urinarytumornecrosisfactorcontributestosodiumretentionandrenalhypertrophyduringdiabetes. Am J Physiol Renal Physiol 284: F113-F121, 2003.

[3]Molitch ME, DeFronzo RA, Franz MA, et al.Diabeticnephropathy. Diabetes Care 23: S69-S73, 2000.

[4]Navarro JF, Mora C, Muros M, Garcia J.Urinarytumournecrosisfactor-αexcretionindependentlycorrelateswithclinicalmarkersofglomerularandtubulointerstitialinjuryintype2diabeticpatients. Nephrol Dial Transplant 21: 3428- 3434, 2006.

[5]Wu J, Ding Y, Zhu C, et al.UrinaryTNF-αandNGALarecorrelatedwiththeprogressionofnephropathyinpatientswithtype2diabetes. Exp Ther Med 6(6): 1482-1488, 2013.

(編輯 文新梅)

Influence of Tumor Necrosis Factor-α on the Expression of Protein Kinase A and Phosphorylation Level of Renal Thick Ascending Limb of Rat

SUI Hongyu1, LI Ying2, QI Shufang1, JIA Xiuyue1, ZHAO Xiaolian1*

(1.Department of Physiology of Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2.First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Objective: To study the effect of TNF-α on the protein expression of PKA and phosphorylation level in the thick ascending limb. Methods: The TNF-α was placed into the tissue of TAL for five minutes to observe the protein expression of PKA and phosphorylation level by using Western blot technique. Results: TNF-α did not change the protein expression of PKA and phosphorylation level in the thick ascending limb (P﹥0.05). Conclusion: The TNF-α can not change the protein expression of PKA and phosphorylation level.

tumor necrosis factor-α; thick ascending limb; protein kinase A

2016-01-05

黑龍江省教育廳科學技術研究項目資助課題。課題名稱：TNF-α對大鼠腎髓袢升支粗段管周膜50pS鉀通道急性效應的研究；編號：12541803；主持人：隋洪玉。

隋洪玉(1976—)，女。佳木斯大學基礎醫學院，副教授，博士。主要研究方向：腎臟生理。

趙曉蓮(1966—)，女。佳木斯大學基礎醫學院，教授，碩士。主要研究方向：糖尿病發病機制及預防。

R-33

B

1672-0601(2017)02-0108-03