抗癌先導物T-OA脂質體的制備及性質研究△

王秀麗，李士遠，王鵬龍，曲昌海，阮婧華

(北京中醫藥大學中藥學院，北京 100102；2.貴陽中醫學院第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001)

抗癌先導物T-OA(3β-羥基齊墩果烷-12-烯-28-酰基-3,5,6-三甲基吡嗪基-2-甲酯)是以臨床常用抗腫瘤復方中的活性成分——齊墩果酸與四甲基吡嗪為原料，利用化學拼合原理，設計并合成的化學實體，分子式為C38H58N2O3，分子量為590.44。T-OA是具有結構新穎和多靶點特性于一體的化學結構，現已注冊國家專利。研究表明，T-OA能較顯著的抑制多種腫瘤細胞的增殖，防止肝癌轉移肺細胞株LM3的侵襲，并且能夠誘導癌細胞凋亡，對正常細胞毒性較低；能明顯抑制CAM模型新生血管增生；對S180小鼠肉瘤的生長有顯著抑制活性，抑制率達到50%；該藥物安全性高，毒性小[1-5]。初步的藥代動力學研究結果顯示，由于T-OA的溶解性差，幾乎不溶于水，影響藥物吸收的速度和程度，其口服生物利用度小于10%，阻礙了藥物的臨床開發與應用。

脂質體作為藥物載體具有靶向性、細胞親和性與組織相容性，提高藥物穩定性等優點。脂質體制備時用的磷脂等材料可生物降解，對機體無毒，故本實驗嘗試把抗癌先導物T-OA制備成脂質體，來改善其在體內的藥動學行為，進而提高T-OA的生物利用度。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters UPLC：二元溶劑管理系統、在線脫氣機、自動進樣器、 PDA 檢測器( Waters公司，美國)；Sartorius BS 110S型電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DW-86L626 型超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)；FD-1C-50冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)；Zetasize Nano ZS 納米粒度儀(英國Malvern 公司)；G16型醫用高速離心機(白洋離心機廠)。

1.2 試藥

抗癌先導物T-OA樣品(北京中醫藥大學中藥學院)；抗癌先導物T-OA標準品(北京中醫藥大學中藥學院)；乙腈(色譜純，Fisher Scientific )；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；大豆磷脂(西安凱新生物科技有限公司，德國Lipoid，S-100)；膽固醇(美國 Amresco)；海藻糖；乳糖；Emprove 低內毒素蔗糖(批號 K43921892)、Emprove低內毒素甘露醇(批號：M759903247)、Emprove 低內毒素甘氨酸(批號：VP559490329)、注射級有機溶劑(批號：DC4DF64301)均由默克化工技術(上海)有限公司提供。

2 T-OA含量測定方法的建立

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×50 mm)；流動相：乙腈-水(98∶2)；流速：0.4 mL·min-1；進樣量：1 μL；樣品室溫度：4 ℃；柱溫：30 ℃；檢測波長：278 nm。

2.2 專屬性試驗

精密稱取T-OA適量，以乙腈配制成一定濃度溶液，分別取空白破乳脂質體溶液、T-OA標準溶液、T-OA破乳脂質體，T-OA溶液進樣分析，考察脂質體中的輔料在此條件下對T-OA的檢測是否有干擾。由圖1可知，磷脂、膽固醇等輔料對T-OA的檢測沒有干擾，專屬性良好。

注：A.標準品；B.含藥脂質體；C.空白脂質體；1. T-OA。圖1 UPLC專屬性試驗結果

2.3 線性、精密度、重復性、穩定性及回收率試驗

線性試驗結果顯示在4.176 ～125.28 μg · mL-1濃度范圍內峰面積和濃度呈良好線性關系，方程為Y=2500X-98.978，r=0.999 9。精密度和重復性試驗結果的RSD分別為0.56%和0.96%，均小于2%，符合要求。24 h內樣品穩定性試驗RSD為0.75%，小于2%，24 h內穩定性良好。回收率試驗結果顯示，高、中、低濃度組T-OA的平均回收率分別為101.79%、 98.89%、100.52%，處于 95%～105%之間，RSD值均小于2%，說明該方法的回收率符合要求。

3 脂質體的制備與處方優化

3.1 T-OA脂質體制備

本文采用冷凍干燥法[6-8]制備T-OA脂質體，具體操作如下：稱取處方量的磷脂、膽固醇和T-OA，加適量的有機溶劑超聲溶解，得到脂質液A；取一定量的保護劑加水超聲溶解，得到保護劑溶液B，然后將A溶液和B溶液混合，混勻后，用0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝于西林瓶中，在-80 ℃冰箱中預凍13 h，取出放入凍干機中，凍24 h，凍干，取出即得T-OA脂質體。

3.2 包封率測定方法

本實驗采用低速離心法[9]測定T-OA脂質體的包封率。取一定體積的脂質體，低轉速條件下離心，精密移取上清液0.1 mL加適量乙腈超聲破乳，UPLC測定藥物含量為W1，另精密移取脂質體混懸液0.1 mL加適量乙腈超聲破乳，UPLC測定藥物含量為W2，包封率(Encapsulation efficiency，EE)計算公式：

EE(%)=W1/W2×100%

(1)

3.3 單因素實驗

以包封率和粒徑為評價指標，考察磷脂與膽固醇的比例、藥脂比例(藥物與脂質材料的質量比)、凍干保護劑的種類、糖脂比例以及有機溶劑與水的比例等因素對T-OA脂質體的影響，進而選出較佳的制備處方。

3.3.1 磷脂與膽固醇的比例對T-OA脂質體的影響 固定其他因素，將磷脂與膽固醇的比例設置成4∶1、6∶1和8∶1三個水平，按照3.1項下的方法制備脂質體，以包封率和粒徑為指標，選出較佳的磷脂與膽固醇比例。

3.3.2 藥脂比例T-OA脂質體的影響 固定其他因素，將藥脂比例設置成1∶6、1∶8和1∶10三個水平，按照3.1項下的方法制備脂質體，以包封率和粒徑為指標，選出較佳的藥脂比例。

3.3.3 保護劑種類對T-OA脂質體的影響 固定其他因素，選用不同的凍干保護劑，按照3.1項下的方法制備脂質體，以包封率和粒徑為指標，選出最佳的保護劑種類。

3.3.4 糖脂比例對T-OA脂質體的影響 固定其他因素，將糖脂比例設成5∶1、6∶1和7∶1三個水平，按照3.1項下的方法制備脂質體，以包封率和粒徑為指標，選出較佳的藥脂比例。

3.3.5 有機溶劑與水的比例T-OA脂質體的影響 固定其他因素，將有機溶劑與水的比例設置成1∶5、1∶3和1∶1三個水平，按照3.1項下的方法制備脂質體，以包封率和粒徑為指標，選出較佳的有機溶劑與水的比例。

4 單因素實驗結果

4.1 磷脂與膽固醇的比例篩選結果

實驗結果如表1所示，根據粒徑和包封率的數據，選擇磷脂和膽固醇的比例為8∶1。

表1 磷脂與膽固醇比例篩選

4.2 藥脂比篩選結果

實驗結果如表2所示，根據粒徑和包封率的數據，選擇藥脂比例1∶10。

表2 藥脂比例篩選

4.3 保護劑種類篩選結果

實驗結果如表3所示，根據粒徑和包封率數據，選出的保護劑為海藻糖。

表3 保護劑種類的篩選

4.4 糖脂比例篩選結果

實驗結果如表4所示，根據粒徑和包封率數據，最終選擇糖脂比例為6∶1。

表4 糖脂比例篩選

4.5有機溶劑與水比例篩選結果

實驗結果如表5所示，根據粒徑和包封率數據，選擇有機溶劑與水的比例為1∶3。

表5 有機溶劑和水比例篩選

綜上，以包封率和粒徑為評價指標，采用單因素實驗篩選出的較佳處方為磷脂與膽固醇的比例為8∶1，藥脂比例為1∶10，糖脂比例為6∶1，有機溶劑與水的比例為1∶3，保護劑為海藻糖。

按照選出的處方制備3批T-OA脂質體，并測定其粒徑和包封率，計算實際值與預測值之間的偏差，結果顯示偏差小于5%，說明單因素實驗篩選得到的工藝條件參數準確。

5 T-OA脂質體藥劑學性質的考察

5.1 粒徑及電位

根據單因素實驗篩選出的處方制備脂質體，然后用Zetasize Nano ZS 納米粒度儀測定粒徑和Zeta 電位。

5.2 體外釋放實驗

T-OA為脂溶性藥物，幾乎不溶于水，需選擇一定的增溶介質。有資料研究表明[3,10]，適當濃度的十二烷基硫酸鈉和吐溫80對T-OA有一定的增溶作用，且十二烷基硫酸鈉的增溶效果較好，故選擇0.5%十二烷基硫酸鈉作為T-OA的體外釋放介質。

精密平行吸取脂質體、同濃度的T-OA混懸液(T-OA經超聲5 min后混懸分散于水中)各3份，每份3 mL置于100 mL 0.5%SDS釋放外液中，在預處理好的透析袋中加入3 mL釋放介質后浸沒于釋放外液中， 37 ℃水浴磁力攪拌，分別于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、30、36 h從透析袋內吸取2 mL釋放介質(同時補加等量，同溫的釋放介質)，測定T-OA的含量，計算藥物的累計釋放百分率并進行模型擬合。

5.3 穩定性實驗

根據單因素實驗采用篩選出的處方制備脂質體，分別于凍干當天，凍干后放置7 d，放置14 d，放置28 d測定其粒徑和包封率。

6 藥劑學性質考察結果

6.1 粒徑與電位

根據選出的處方制備脂質體，測得的粒徑、電位結果見圖2、圖3。

圖2 T-OA脂質體粒徑分布圖

圖3 T-OA脂質體Zeta電位結果

6.2 體外釋放實驗

如圖4所示，脂質體中藥物的累計釋放率比原藥的高，T-OA體外釋放曲線符合Weibull方程，r=0.9895 。

圖4 體外釋放結果

6.3 穩定性實驗結果

實驗結果如表6所示，從粒徑和包封率可以看出，隨著放置時間的延長，T-OA脂質體的粒徑有所增大，但是粒徑仍小于250 nm；包封率有所減小，但仍大于90%，說明凍干脂質體在一個月內是相對穩定的。

表6 定性試驗結果

7 討論

由于抗癌先導物T-OA溶解性差，幾乎不溶于水，影響藥物吸收的速度和程度，其口服生物利用度低，阻礙了藥物的臨床開發與應用。脂質體的磷脂雙分子層，使其具有細胞親和性與組織相容性，同時，難溶性藥物能夠以分子狀態存在于磷脂雙分子層，因此，將難溶性藥物包載于脂質體能夠促進其釋放、吸收。本文的釋放結果也很好地證明了將T-OA包載于脂質體能夠促進其釋放。

筆者同時也對T-OA脂質體的口服藥代動力學進行了考察，并對T-OA的腸淋巴轉運情況進行了研究。實驗結果顯示，T-OA脂質體口服給藥后，由于血漿樣品中藥物含量小于最低檢測限，無法在血漿樣品中檢測到T-OA。但在淋巴樣品中能夠檢測到T-OA，且脂質體組藥物在淋巴中的累積轉運量顯著高于T-OA混懸液給藥，因為脂質體的脂性結構有助于增加T-OA 口服后的腸淋巴轉運，促進T-OA吸收(另文發表)。

脂質體制備的方法有很多，常用的是薄膜分散法，但存在制備工藝繁瑣、不適合工業放大、液態產品不穩定等問題。而冷凍干燥法[11]是一種低溫下物質干燥的過程，優點：(1)能減少揮發性成分及受熱變性成分(如磷脂)的損失；(2)干燥后體積、形狀基本不變，復溶性好；(3)能保護易氧化的物質；(4)能提高穩定性，延長保存時間。故本實驗選擇用冷凍干燥法制備T-OA脂質體。

單因素實驗結果顯示，磷脂與膽固醇的比例、有機溶劑與水的比例對T-OA脂質體的包封率和粒徑結果影響較大，其次是凍干保護劑、藥脂比例、糖脂比例等因素。海藻糖[12]為葡萄糖的非還原雙糖，在本實驗中被選為凍干保護劑，它最明顯的性質為在無水條件下有保護生物膜的能力。海藻糖是通過氫鍵與磷脂膜的極性基團結合起來穩定脫水的膜，有效地取代了在極性基團周圍的殘余水分，這種“水置換”改變了凍干脂質體膜組成的物理性質，闡明了缺少水的穩定性。但過量的凍干保護劑在凍干過程中會促進脂質體顆粒的聚集，使粒徑和離散度均有一定增大，選用適當的凍干保護劑可提高包封率數據，最終選擇的糖脂比為6∶1。

8 結論

本研究采用冷凍干燥法制備的T-OA脂質體包封率較高，提高了T-OA的溶解度，且建立了精密度、重復性、穩定性均良好的T-OA含量測定方法。使用冷凍干燥法制備T-OA脂質體，以包封率及粒徑為指標，應用單因素法進行處方優化。最終確定的最佳處方為磷脂與膽固醇比例為8∶1，藥脂比例為1∶10，糖脂比例為6∶1，有機溶劑與水比例為1∶3，凍干保護劑為海藻糖。此制備工藝簡單，重現性及穩定性較好，適合工業放大生產，所得脂質體粒徑均一，大小在200 nm左右，包封率為93.24%；體外釋放結果顯示T-OA脂質體的累積釋放度比T-OA混懸液高，釋放曲線符合Weibull方程。