海南省不明原因發熱病人中鉤端螺旋體病的實驗檢測結果分析

吳 捷,王 丹,王少玲, 陳 莉,葉浩然,杜中華, 華 德,李丹丹,蔣秀高

海南省不明原因發熱病人中鉤端螺旋體病的實驗檢測結果分析

吳 捷1,王 丹1,王少玲1, 陳 莉1,葉浩然1,杜中華1, 華 德1,李丹丹1,蔣秀高2

目的 了解海南省不明原因發熱病人中鉤端螺旋體病的感染情況。方法 分別用鉤端螺旋體顯微鏡凝集試驗(MAT)、酶聯免疫試驗(ELISA)和聚合酶鏈反應(PCR)法，檢測海南省2015年全省不明原因發熱病人的血標本。結果 共檢測標本179份，其中顯微鏡凝集試驗檢出陽性標本40份，感染率為22.35%，男性感染率為21.65%(21/97),女性感染率為23.17%(19/82)；菌群中有7個群能檢出，分別是問號鉤端螺旋體黃疸出血群、拜倫群、秋季熱群、波摩那群、流感傷寒群、賽羅群、塔拉索夫群；酶聯免疫試驗檢測陽性38份，陽性率為21.23%，其中IgM陽性6份，檢出率為3.35%，IgG陽性32份，檢測率為17.88%；血清學檢測結果一致。PCR法檢測結果均為陰性。結論 海南省不明原因發熱病人中存在鉤端螺旋體的感染，主要型別以黃疸出血群為主。

鉤端螺旋體病；血清學；聚合酶鏈反應；海南省

鉤端螺旋體病(Leptospirosis)簡稱鉤體病，是由各種致病性鉤端螺旋體引起的一種急性全身性感染的自然疫源性疾病[1]。該病的臨床癥狀表現為高熱、結膜充血、腓腸肌壓痛、全身酸痛，溶血性貧血，肺出血，嚴重時可出現全身出血傾向、肝、腎、中樞神經系統損害。病例流行常與洪澇災害有關[2]。近年來，雖然海南省鉤體病的發病率有所下降，但是海南省是自然災害頻繁且較為嚴重的地區，傳播流行常與洪澇災害有關的鉤體病也應該要引起我們的關注。本研究對2015年全省不明原因發熱病人進行了鉤端螺旋體病的調查研究。

1 材料與方法

1.1 標本來源 采取2015年海南省不明原因持續發熱≥38.5 ℃病人血清標本179份，其中女性82份(45.81%)，男性97份(54.19%)，年齡范圍為3歲—98歲，平均年齡為 51 歲。

1.2 試劑 人血清鉤端螺旋體IgM/IgG抗體檢測試劑盒購自德國賽潤公司，批號為：20160829；病人血液標本DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，所需引物由上海生工合成，Taq酶和DL2000 Markers分子量對照由TaKaRa公司提供。

1.3 血清抗體檢測方法

1.3.1 鉤體顯微鏡凝集試驗(MAT)按照《鉤端螺旋體診斷標準-中華人民共和國衛生行業標準》WS290-2008 進行試驗操作和結果判定。血清抗體滴度≥1∶400為陽性。

1.3.2 酶聯免疫試驗(ELISA)原理 運用抗原與抗體的特異性反應特點，將所需的特異性病原體抗原包被在檢測微孔板的檢測條上，如果病人血清標本中含有抗體，抗體就可與包被的抗原結合形成了免疫復合物。具有堿性磷酸酶標記的二抗繼而與免疫復合物結合，無色的底物對硝基苯磷酸鹽被轉變為有色產物對硝基苯酚。樣本中抗體的濃度與反應物的顏色深淺成正比，并可用吸光度測量來表示。按試劑說明書進行試驗操作，在405 nm下，讀取OD值。

1.3.3 PCR法 按照《WS290-2800》中提供的序列合成所需引物1∶5，-CTGAATCGCTGTATAAAAGT-3，引物2：5，-GGAAAACAAATGGTCGGAAG-3，反應總體系為25 μL，包含：Pre Mix Taq 12.5 μL，上引物和下引物(10 μmol/L)各0.5 μL，模板5 μL，無菌去離子水2.5 μL。反應步驟為：首先94 ℃預變性 5 min，接著94 ℃變性60 s，然后55 ℃退火60 s，再是72 ℃延伸90 s，共計35個循環，最后72 ℃總延伸10 min，擴增產物分子大小為：285 bp。

1.4 統計分析：用Excel表格統計和處理數據資料，實驗結果的比較用χ2檢驗，統計分析采用SPSS 20.0 進行結果分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 疫情報告情況 據“中國疾病預防控制信息系統”資料顯示：海南省2010年鉤體發病率0.03/10萬,2011年為0.05/10萬,2012年為0.05/10萬,2013年為0.03/10萬,2014年為0.07/10萬，2015年為0.02/10萬；病例主要分布情況為：2010年文昌3例，2011年文昌1例，東方1例，屯昌1例，樂東1例，2012年三亞1例，文昌2例，樂東1例，2013年海口1例，儋州1例，陵水1例；2014年海口1例，儋州2例，文昌2例，澄邁1例；2015年儋州2例。

2.2 2015年由醫院送檢的不明原因發熱病人概況 市縣分布有海口20例，澄邁6例，儋州3例，屯昌9例，白沙13例，保亭8例，樂東12例，東方10例，瓊中9例，臨高25例，定安14例，萬寧7例，文昌8例，瓊海7例，昌江6例，陵水8例， 三亞5例，五指山5例，洋浦4例，總共179例，其中女性82例，男性97例，平均年齡為 51歲，職業以農民為主。鉤體病既往感染或現癥感染40例，市縣分布為：海口市2例，屯昌縣6例，瓊海市1例，臨高縣7例，樂東縣4例，瓊中縣3例，五指山市1例，陵水縣1例，保亭縣5例，萬寧市2例，文昌市1例，定安縣1例，東方市2例，昌江縣1例和白沙縣3例，分布范圍廣泛。近期多有田間勞作可疑疫水接觸史，家中老鼠活動頻繁，同時出現發熱、頭暈、頭痛、畏寒、腓腸肌痛、結膜充血、皮膚鞏膜黃染、淋巴結腫大、全身肌肉酸痛、乏力、食欲減退、嘔吐等單一癥狀或多種癥狀，外周血WBC多數伴有升高，經青霉素治療好轉。

2.2.1 性別分布 被檢測的不明原因發熱病人有179例，顯微鏡凝集試驗檢出陽性標本40份，感染率為22.35%，男性21人陽性，感染率為21.65%(21/97),女性19人陽性,感染率為23.17%(19/82)；酶聯免疫試驗檢測陽性38份，陽性率為21.23%，男性21人陽性，感染率為21.65%(21/97), 女性17人陽性,感染率為20.73%(17/82)。兩種方法檢測男女之間鉤端螺旋體血清抗體陽性率差異均無統計學意義。

2.2.2 年齡分布 共觀察的不明原因發熱病例數有179份，顯微鏡凝集試驗法(MAT)和ELISA法檢驗的P值均大于0.05，表示各年齡間均無統計學意義(見表1)。

2.2.3 季節分布 病人發病月份主要集中在6-11月份，這主要與海南省的多雨季節以及水稻收割工作有關。

表1 MAT和ELISA方法中的年齡分布的比較

Table.1 Comparison of age distribution in MAT and ELISA methods

方法MethodMATELISA陽性Positive陰性Negative陽性Positive陰性Negative20歲以下Under20years41223021-3032244631-4042685241-50102045651-60736105961歲以上Above61yeas12231059χ28.8863.633P0.1140.603

2.3 實驗結果

2.3.1 鉤端螺旋體MAT菌群與滴度分布 表1中，各個年齡段均有鉤端螺旋體感染，鉤端螺旋體總感染率為22.35%(40/179)，男性感染率為21.65%(21/97),女性感染率為23.17%(19/82)；鉤端螺旋體顯微鏡凝集試驗以≥1∶400為陽性，總陽性率為5.03%(9/179)，1≥100為弱陽性率，弱陽性率則為17.32%(31/179)；菌群中有7個群能檢出，分別是黃疸出血群(56601)、拜倫群(56604)、秋季熱群(56606)、波摩那群(56608)、流感傷寒群(56609)、賽羅群(56635)、塔拉索夫(56613)；黃疸出血群(56601)檢出的例數最多占26例，其次是賽羅群(56635)有5例檢出；MAT滴度達1∶800有2例，其中1例是黃疸出血群(56601)、1例是賽羅群(56635)；滴度達1∶400有6例，黃疸出血群(56601)和賽羅群(56635)分別有4例和2例；MAT滴度1∶100最多是黃疸出血群(56601)有13例，MAT滴度1∶200最多也是黃疸出血群(56601)有8例；其他見表2中所示。

2.3.2 酶聯免疫試驗檢測陽性38份，陽性率為21.23%，其中IgM陽性6份，檢出率為3.35%，IgG陽性32份，檢測率為17.89%；血清學檢測結果一致。PCR法檢測結果均為陰性。

3 討 論

鉤體病是一種人獸共患的自然疫源性疾病，它的暴發流行受自然因素(氣溫、地形、降水量等)，生物因素(如鼠密度、鼠帶菌率等)以及社會因素(居住環境、生活條件等)的影響[3-4]。鉤體病的宿主動物多，感染動物的腎臟可成為主要的儲存菌器官，鼠類和豬作為該病的主要帶菌宿主，可長期通過尿液排菌，形成傳染源[5-10]。海南島位于熱帶北緣，屬于熱帶季風氣候，氣候潮濕溫暖，有明顯的多雨季和少雨季，每年的11月至翌年4月為少雨季，5-10月為多雨季，雨源主要有熱雷雨、鋒面雨和臺風雨，年平均降雨量1 639 mm。河流密布，植物繁多，森林覆蓋率高達40%，植被生長快，是熱帶季雨林和熱帶雨林的原生地，非常適合多種野生動物棲息和繁衍，尤其的海南島一年四季農作物豐富，也為老鼠的大量繁殖提供了生存條件。潘會明等報道鼠密度與鉤體病的發病率密切相關[11-12],表明鼠類是傳播鉤體病的重要傳染源之一，提示我們今后要以滅鼠為工作重點來進行鉤體病的防治。

表2 海南省鉤端螺旋體MAT菌群及滴度分布

Table.2 Distribution of leptosperosis MAT group and titers in Hainan Province

菌群號GroupNo.MAT滴度MATTiter1∶1001∶2001∶4001∶800合計566011384126566041100256606020025660802013566091000156613100015663511215合計17146340

上個世紀70年代鉤體病曾在海南有過較大流行，90年代潘祖安等人對海南省9個市縣中10個鄉鎮529份健康人群的血清進行抗體檢測[13]，提示各地感染率為25.9%～72.2%不等；筆者也曾對1999—2002年海口地區各醫院送檢的96份疑是鉤體病患者進行抗體檢測，感染率為36.5%[14]，這些資料證實海南省健康人群中存在鉤體病的感染，散發病例常年發生。90年代鉤體感染與性別無關，與職業和年齡密切相關，而且感染的血清群以巴達維亞群、黃疸出血群和流感傷寒群為主。從本次調查結果看，鉤體感染與性別無關，這點再次得到證實，各個年齡段均可感染，感染的血清群主要以黃疸出血群為優勢群，這與90年代潘祖安等人的調查有所不同，鉤端螺旋體菌群出現的變化，這點值得引起我們的關注，警示我們要留意鉤端螺旋體菌群更迭而引起鉤體病的暴發流行[15-16]。

(本調查得到中國疾控中心傳控所鉤體室以及廣西省疾控中心的大力支持，特此感謝！)

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Leptospirosis detection among patients with fever in Hainan Province, China

WU Jie1, WANG Dan1, WANG Shao-ling1, CHEN Li1, YE Hao-ran1,
DU Zhong-hua1, HUA De1, LI Dan-dan1, JIANG Xiu-gao2

(1.HainanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Haikou570203,China; 2.ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

We investigated the situation of leptosperosis infection among patients with fever in Hainan Province in China. Blood samples of patient from Hainan Province in the year of 2015 were detected forLeptospiraby microscope agglutination test (MAT), enzyme-linked immunity test (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR), respectively. Results showed that 179 blood samples of patients with fever were found, and microscope agglutination test detected 40 positive samples, with a infection rate of 22.35%. The infection rate was 21.65%(21/97) for male and 23.17%(19/82) for female. Seven groups of bacteria were found includingLeptospiraserogroup icterohemorrhagie, ballom group, autumralis group, pomona group, grippotyphosa group, Sejroe group and Batavia group. Thirty-eight samples were tested positive by ELISA, with a positive rate of 21.23%, in which six samples were IgM positive (detection rate =3.35%) and 32 samples were IgG positive (detection rate=17.88%). Serological detected with MAT and ELISA methods results were consistent and that were tested negative by PCR. Results of our study supported the presence ofLeptospirainfection infection among the patients with fever of unknown origin (FUO) in Hainan Province. The main types areLeptospiraserogroup icterohemorrhagie.

leptospirosis; serology; polymerase chain reaction; Hainan Province Supported by the Nature Science Foundation of Hainan Province (No. 20168332) Corresponding author: Jiang Xiu-gao, Email: jiangxiugao@icdc.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.016

海南省自然科學基金項目(No.20168332)

蔣秀高，Email: jiangxiugao@icdc.cn

1.海南省疾病預防控制中心，海口 570203； 2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，北京 102206

R377

A

1002-2694(2017)03-0276-04

2016-10-11 編輯：王曉歡