幼稚和記憶T細胞在NSCLC放療患者中的表達及其預(yù)后價值

劉超 吳世凱 劉廣賢 申戈 王微 孟祥穎 孫冰 叢陽 趙耀巍 高紅軍

·臨床研究與應(yīng)用·

幼稚和記憶T細胞在NSCLC放療患者中的表達及其預(yù)后價值

劉超 吳世凱 劉廣賢 申戈 王微 孟祥穎 孫冰 叢陽 趙耀巍 高紅軍

目的：探討幼稚和記憶T細胞在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）放療患者外周血中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系。方法：采用流式細胞儀檢測2014年9月至2016年5月解放軍307醫(yī)院40例接受放療的NSCLC首診患者，治療前外周血中幼稚CD4+T細胞、記憶CD4+T細胞、幼稚CD8+T細胞、記憶CD8+T細胞，與14例健康人進行對比，并分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：與健康組相比，NSCLC患者幼稚CD4+T細胞下降（P=0.031），記憶CD4+T細胞和記憶CD8+T細胞升高（P=0.014、0.005）。與不吸煙患者相比，吸煙患者幼稚CD4+T細胞較低（P=0.043），記憶CD4+T細胞較高（P=0.024）。與ECOG評分1～2分者相比，0分者幼稚CD8+T細胞較低（P=0.017），記憶CD8+T細胞較高（P=0.020）。單因素分析顯示幼稚CD4+T細胞較高組放療后中位無進展生存期（median progression free survival，mPFS）更長（17個月vs.9個月，P=0.044）、記憶CD4+T細胞較高組放療后mPFS可能更短（9個月vs.15個月，P=0.069）。Cox多因素分析顯示幼稚CD4+T細胞與患者放療后無進展生存期（progression free survival，PFS）獨立相關(guān)（P=0.009）。結(jié)論：NSCLC患者外周血中幼稚T細胞儲備下降，記憶T細胞上升。幼稚CD4+T細胞較高可能預(yù)示放療后PFS更長。

非小細胞肺癌 立體定向放療 幼稚T細胞 記憶T細胞 免疫

肺癌是我國發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤［1］。近年來，單用放療或放療聯(lián)合其他治療已成為半數(shù)以上腫瘤患者的一線治療方法［2］。立體定向放療逐漸成為肺癌的主要治療方法，尤其在早期肺癌中療效顯著［3］，其生物學(xué)機制也逐漸明朗，除對腫瘤細胞的DNA產(chǎn)生直接損傷外，免疫機制也占有重要作用［4］。據(jù)此，推測放療前的免疫狀態(tài)與患者預(yù)后存在相關(guān)性。既往研究通常探討CD3、CD4、CD8以及調(diào)節(jié)T細胞在非小細胞肺癌（non-small cell lung can?cer，NSCLC）中的臨床意義［5-6］，而對于幼稚和記憶T細胞鮮有報道。因此，本研究探討NSCLC患者放療治療前外周血幼稚和記憶T細胞的表達情況并分析其預(yù)后價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

2014年9月至2016年5月接受放療的NSCLC首診患者40例。其中男性28例，女性12例。入組標(biāo)準(zhǔn)：1）經(jīng)病理確診NSCLC；2）年齡＞18歲；3）ECOG評分≤2分；4）入組前未接受任何抗腫瘤治療；5）入組前3 d內(nèi)未接受激素治療；6）無明顯感染、免疫相關(guān)疾病、移植病史；7）非雙原發(fā)癌患者。同時納入14例年齡、性別相匹配的健康人作為對照組。本研究經(jīng)過被研究對象或其家屬知情同意并得到醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 治療方案 入組患者的治療為單用放療或聯(lián)合化療及靶向治療。放療方案包括立體定向放療（射波刀：30～50 Gy/5次）和常規(guī)分割放療（加速器：60～66 Gy/30～33次）。化療方案是以鉑類為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案。共2例患者接受放療聯(lián)合靶向治療，其中1例EGFR突變患者接受特羅凱治療，1例ALK突變患者接受克唑替尼治療。

1.2.2 隨訪 患者接受一線治療后每隔3個月隨訪一次，隨訪截止日期為2016年11月15日。研究終點為無進展生存期（progression free survival，PFS），定義為從治療開始至出現(xiàn)RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)［7］定義的疾病進展（progressive disease，PD）或死亡時間。

1.2.3 外周血的采集及流式檢測 患者于治療前1周內(nèi)采集患者外周血并進行流式檢測。共檢測以下4群細胞：CD4+CD45RA+CD45RO-（幼稚CD4+T細胞）、CD4+CD45RO+CD45RA-（記憶CD4+T細胞）、CD8+CD45RA+CD45RO-（幼稚CD8+T細胞）、CD8+ CD45RO+CD45RA-（記憶CD8+T細胞）。使用FlowJo Version 10數(shù)據(jù)分析軟件計算幼稚和記憶T細胞占CD4和CD8陽性細胞百分比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。幼稚和記憶T細胞數(shù)據(jù)以x±s表示。使用兩獨立樣本t檢驗比較NSCLC患者與健康人幼稚和記憶T細胞比例的差異及幼稚和記憶T細胞與臨床病理的關(guān)系。采用Ka?plan-Meier法分析PFS，并進行Log-Rank檢驗、單因素分析、Cox多因素分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理和隨訪信息

40例NSCLC患者中男性28例、女性12例，年齡36～90歲，中位年齡為64.5歲，有吸煙史者26例、無吸煙史者14例。鱗癌19例、腺癌19例、其他類型2例，中高分化24例、低分化9例、分化程度未知7例，ECOG評分為0分者16例、1分者22例、2分者2例，根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（第7版）肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為4、8、17、11例。40例患者中24（60%）例接受射波刀治療，包括4例Ⅰ期患者、7例Ⅱ期患者、11例Ⅲ期患者和2例Ⅳ期患者；16（40%）例接受常規(guī)分割放療，包括1例Ⅱ期患者、6例Ⅲ期患者和9例Ⅳ期患者。至隨訪截止，共有26例患者出現(xiàn)PD或死亡，全組患者mPFS為12.5（6～22）個月。

2.2 NSCLC患者與健康人幼稚和記憶T細胞對比

NSCLC患者幼稚CD4+T細胞比例降低、記憶CD4+T細胞和記憶CD8+T細胞比例升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 NSCLC患者與健康人幼稚和記憶T細胞對比Table 1 Differences in naive and memory T cells between patients with NSCLC and healthy controls

2.3 幼稚和記憶T細胞與臨床病理信息的關(guān)系

與不吸煙患者相比，吸煙患者幼稚CD4+T細胞比例更低，記憶CD4+T細胞比例更高。與ECOG評分為1～2分患者相比，ECOG評分為0分的患者幼稚CD8+T細胞下降，記憶CD8+T細胞上升。其他臨床病理因素的比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

2.4 單因素分析

幼稚和記憶T細胞比例分組的生存曲線見圖1。Log-rank法單因素預(yù)后分析顯示幼稚CD4+T細胞比例＜19與≥19組相比，mPFS為9個月vs.17個月（P= 0.044）；腫瘤中高分化與低分化組相比，mPFS為17個月vs.8個月（P=0.001）；ECOG評分0分與1～2分組相比，mPFS為17個月vs.11個月（P=0.047）；臨床分期Ⅰ～Ⅲ與Ⅳ期組相比，mPFS為17個月vs.10個月（P=0.008）。記憶CD4+T細胞比例與PFS存在相關(guān)性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.069）。

2.5 多因素分析

將單因素分析中P＜0.05的因素納入多因素分析，結(jié)果顯示幼稚CD4+T細胞比例、臨床分期、分化程度是影響PFS的因素（表3）。

表2 NSCLC患者幼稚和記憶T細胞與臨床病理信息的關(guān)系Table 2 Associations between naive and memory T cells and clinicopathologic characteristics

圖1 幼稚和記憶T細胞比例高、低組生存曲線比較Figure 1 Progression free survival of 40 patients with NSCLC stratified by naive and memory T cells

3 討論

幼稚T細胞是一類未經(jīng)抗原刺激的T細胞，在腫瘤患者中經(jīng)腫瘤抗原刺激后分化為記憶T細胞，進而轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T細胞發(fā)揮細胞免疫功能。目前，根據(jù)CD45RA和CD45RO的表達，將CD45RA+CD45RO-細胞群定義為幼稚T細胞、CD45RO+CD45RA-細胞群定義為記憶T細胞［8］。再根據(jù)CD4（輔助性細胞）和CD8（殺傷性細胞）表達將幼稚和記憶T細胞分為幼稚CD4+T細胞、記憶CD4+T細胞、幼稚CD8+T細胞和記憶CD8+T細胞4類［9］。本研究發(fā)現(xiàn)與健康人相比，NSCLC患者幼稚CD4+T細胞比例降低、記憶CD4+T細胞和記憶CD8+T細胞比例升高。幼稚CD4+T細胞比例與NSCLC患者放療后PFS呈顯著相關(guān)性。

表3 40例NSCLC患者Cox多因素預(yù)后分析Table 3 Cox multivariate analysis of progression free survival of 40 patients with NSCLC

目前，僅有極少數(shù)研究探索幼稚和記憶T細胞在肺癌中的表達。Hara等［10］發(fā)現(xiàn)肺癌患者與健康人相比，幼稚CD4+T細胞和幼稚CD8+T細胞降低、記憶CD4+T細胞和記憶CD8+T細胞升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與納入患者多為早期有關(guān)。Prado-Garcia等［11］也發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者幼稚CD8+T細胞降低、記憶CD8+T細胞升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能因病例數(shù)較少。本研究發(fā)現(xiàn)40例NSCLC患者外周血幼稚CD4+T細胞下降（P= 0.031），記憶CD4+T細胞和記憶CD8+T細胞升高（P=0.014、0.005）。這可能提示NSCLC患者體內(nèi)幼稚T細胞受腫瘤抗原刺激后向記憶T細胞轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致幼稚T細胞儲備下降，記憶T細胞產(chǎn)生增加，具體生物學(xué)機制仍需進一步研究確定。

單因素和多因素分析均發(fā)現(xiàn)幼稚CD4+T細胞與NSCLC放療后PFS顯著相關(guān)（P=0.044、0.009）。幼稚CD4+T細胞比例較高組mPFS與較低組相比為17個月vs.9個月。記憶CD4+T細胞與PFS呈負相關(guān)（P= 0.069）。其可能的主要機制：1）外周血中記憶CD4+T細胞增殖能力較弱，再次遇到抗原時很難產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答［12-13］；2）與之相反，幼稚CD4+T細胞初次接觸腫瘤抗原后可快速增殖分化產(chǎn)生效應(yīng)T細胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答［14］；3）放療后腫瘤抗原得到暴露并產(chǎn)生新抗原［15］，幼稚T細胞儲備較多時可能產(chǎn)生強烈的免疫應(yīng)答；確切的機制目前尚不清晰。

本研究樣本量較小、治療方案不均一、放療劑量及分割次數(shù)不統(tǒng)一、隨訪時間較短（無總生存數(shù)據(jù)），對研究結(jié)果有一定影響。但本研究結(jié)果仍提示幼稚CD4+T細胞與NSCLC患者放療后生存呈顯著相關(guān)。同時，與健康人相比，NSCLC患者幼稚T細胞儲備下降、記憶T細胞比例上升。本研究結(jié)果可能應(yīng)用于放療優(yōu)勢人群的選擇，但仍需大樣本研究證實和進一步探索。

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（2016-12-09收稿）

（2017-01-13修回）

（編輯：楊紅欣 校對：孫喜佳）

Naive and memory T cells in patients with non-small cell lung cancer treated with radiotherapy and their prognostic value

Chao LIU,Shikai WU,Guangxian LIU,Ge SHEN,Wei WANG,Xiangying MENG,Bing SUN,Yang CONG,Yaowei ZHAO,Hongjun GAO Correspondence to:Shikai WU;E-mail:skywu4923@sina.com
Cancer Therapy Center,307 Clinical College of PLA,Anhui Medical University,Beijing 100071,China

Objective:To investigate the expression of naive and memory T cells in peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)treated with radiotherapy and their prognostic value.Methods:Pretreatment peripheral blood samples obtained from 40 patients with NSCLC treated via radiotherapy and 14 healthy controls were analyzed by flow cytometry for naive CD4+T cells,memory CD4+T cells,naive CD8+T cells,and memory CD8+T cells.We evaluated the relationships between these cells and patient characteristics and the prognosis of patients.Results:Compared with healthy controls,patients with NSCLC showed decreased naive CD4+T cells (P=0.031)and increased memory CD4+T cells(P=0.014)and memory CD8+T cells(P=0.005).Smokers showed lower naive CD4+T cells (P=0.063)and higher memory CD4+T cells(P=0.024)than nonsmokers.Patients with good performance status exhibited decreased naive CD8+T cells(P=0.017)and increased memory CD8+T cells(P=0.020).Univariate analysis revealed that increased naive CD4+T cells were correlated with better progression-free survival after radiotherapy(17 vs.9 m,P=0.044),whereas elevated memory CD4+T cells may be correlated with poor progression-free survival after radiotherapy(9 vs.15 m,P=0.069).Multivariate analysis demonstrated that naive CD4+T cells were independently associated with progression free survival after radiotherapy(P=0.009).Conclusion:Patients with NSCLC showed decreased naive T cells and increased memory T cells.Elevated naive CD4+T cells may predict longer progression free survival after radiotherapy.

non-small cell lung cancer,stereotactic body radiation therapy,naive T cell,memory T cell,immunity

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.04.411

安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍307臨床學(xué)院腫瘤中心（北京市100071）

吳世凱 skywu4923@sina.com

劉超 專業(yè)方向為放射與免疫治療。

E-mail：liutangchao@hotmail.com