環孢素A抑制親環素A對多發性骨髓瘤細胞增殖的影響*

邱鳴寒 王中秋 劉曉潔 Kumar.SHAJI 袁智勇

·基礎研究·

環孢素A抑制親環素A對多發性骨髓瘤細胞增殖的影響*

邱鳴寒①王中秋①劉曉潔①Kumar.SHAJI②袁智勇①

目的：親環素A（cyclophilinA，CyPA）在多種腫瘤組織中高表達，在腫瘤形成發展中扮演重要的角色。本研究對CyPA在多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者骨髓標本中的表達及其對MM細胞增殖、凋亡能力的影響進行研究，探討其與MM發生、進展的相關性。方法：采用ELISA法檢測骨髓標本及細胞培養上清中CyPA水平。不同濃度環孢素A（cyclosporin A，CsA）刺激MM細胞，CCK-8法檢測細胞增殖能力、Western blot法檢測PARP蛋白裂解評價細胞凋亡水平。結果：單克隆免疫球蛋白血癥、冒煙型骨髓瘤、MM患者骨髓中CyPA濃度逐漸升高，至MM達最高值，患者治療后CyPA濃度明顯下降。CsA處理MM細胞后，CyPA分泌減少，隨時間延長細胞增殖能力呈濃度依賴性逐漸減弱，PARP蛋白裂解增加、細胞凋亡增多。結論：隨MM惡性程度增加，骨髓中CyPA濃度顯著升高，經治療緩解后CyPA濃度顯著下降，CyPA介導的細胞增殖在MM致癌機制中可能起關鍵作用。CsA作為CyPA作用的抑制劑，具有促進細胞凋亡、阻礙細胞增殖的作用，無免疫抑制作用的CsA衍生物可能是潛在的MM有效治療手段。

多發性骨髓瘤 親環素A 環孢素A 細胞增殖 細胞凋亡

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種起源于B淋巴細胞的血液惡性腫瘤，特征表現是惡性漿細胞克隆性異常增殖，導致患者出現腎功能不全、貧血和骨質破壞等多器官損害［1］。當前MM臨床治療仍然十分困難，現有多種治療手段雖然可以顯著提高患者的緩解率和生存期，但大部分患者達到平臺期后，疾病進展和復發仍不可避免［2］。因此，尋找新型、高效、低毒的治療藥物和可靠的預后評估手段成為研究的焦點。

親環素A（cyclophilinA，CyPA）是親環素（cyclophilin，CyP）家族成員，在細胞凋亡、細胞間信號傳導等多種生物學過程中具有至關重要的作用［3］。CyPA在乳腺癌、胰腺癌、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）等多種腫瘤組織中呈高表達，在腫瘤形成發展中扮演重要的角色［4-5］。本研究選取25例確診MM患者的骨髓標本及4種骨髓瘤細胞株作為研究對象，探討CyPA表達水平與骨髓瘤進展的相關性以及對骨髓瘤細胞增殖凋亡的影響，旨在為CyPA在多發性骨髓瘤中的發病機理提出佐證，并為治療和預后評估方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

骨髓標本由美國梅奧診所（Division of Hematology，Mayo Clinic）Kumar.Shaji教授饋贈。從梅奧診所收集2000年7月至2015年1月間典型MM患者25例，其中男性14例，女性11例，平均年齡46歲，分別于化療前、后收集標本［治療方案包括硼替佐米（萬珂）聯合地塞米松方案或沙利度胺方案］。另選取性別、年齡與患病組相匹配的MM瘤前階段患者作為對照，包括意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥（monoclonal gammopathies of undetermined significance，MGUS）患者25例及冒煙型骨髓瘤（smoldering myeloma，SMM）患者20例。每例留存骨髓標本5 mL，-80℃凍存備用。

骨髓瘤細胞株MM1S、RPMI、OPM-2、U266由美國哈佛醫學院（Dana Farber Cancer Institute）Ruben. D.Carrasco教授饋贈，采用含10%FBS的RPMI1640培養基培養，置于37℃、5%CO2、濕度充分的恒溫培養箱，每3～4 d按1∶3比例傳代細胞。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理 CyPA抑制劑環孢素CsA（購自美國Sigma-Aldrich公司），DMSO溶解后配成10 mM濃度存儲備用。無血清培養基培養MM細胞6 h后，分別采用1、5、10 μM工作濃度CsA刺激細胞24、48、72 h進行后續實驗。

1.2.2 ELISA法檢測CyPA濃度 人CyPA-ELISA試劑盒（購自武漢優爾生公司），采用雙抗體夾心法，按照說明書具體步驟完成檢測。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖 接種單細胞懸液于96孔板，每孔100 μL含8 000個細胞，每組設6個復孔，不同處理時間后，加入CCK-8溶液10 μL，繼續培養2 h后在450 nm波長下，酶聯免疫分析儀測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫軸，光吸收值的比值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.2.4 Western blot檢測凋亡蛋白PARP的表達 提取細胞總蛋白，每孔加樣30 μg，常規電泳分離、轉膜后室溫封閉1 h。PARP一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗滌后二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌、ECL化學發光法檢測，Quantity one（Bio-Rad）軟件半定量分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0統計進行統計學分析，結果均以mean±SD表示。ELISA和Western blot的比較采用方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用LSD法；增殖實驗的結果是取3次實驗結果的平均值，比較采用析因設計的方差分析；參數比較前進行方差齊性檢驗，在方差齊性的基礎上進行比較，方差不齊時采用非參數檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 骨髓中CyPA濃度隨MM疾病進展逐漸升高

MGUS被認為是漿細胞瘤前病變，可進一步發展為SMM，此時進展為MM的危險度明顯升高。ELISA檢測結果顯示：隨著疾病進展，CyPA濃度不斷升高，MGUS組CyPA濃度最低，至MM組達最高值，差異具有統計學意義（P＜0.001）。MM患者接受治療后收集標本進行檢測，CyPA濃度則明顯下降（P＜0.001，圖1）。

圖1 ELISA法檢測CyPA在MGUS、SMM及治療前、后的典型多發性骨髓瘤患者骨髓標本中的濃度Figure 1 CyPA levels in bone marrow in patients with MGUS,SMM, and MM were determined through ELISA

2.2 CsA處理抑制骨髓瘤細胞中CyPA的分泌

10 μM工作濃度CsA處理骨髓瘤細胞，24 h后收集細胞培養上清，ELISA法檢測CyPA的分泌情況。發現CsA刺激在4種細胞中均可抑制CyPA的分泌，其中對MM1S細胞的作用最強，對RPMI細胞的作用稍弱（圖2），提示CsA對CyPA的作用具有廣泛性，而非細胞特異性。

2.3 CsA處理抑制骨髓瘤細胞增殖、促進凋亡

CCK-8檢測結果顯示，CsA刺激可抑制骨髓瘤細胞的增殖能力；在0～72 h內，細胞的增殖能力總體上有隨著時間增長而逐漸減弱的趨勢。與未處理組細胞相比，受CsA刺激后的MM1S細胞的增殖能力明顯減弱，且在刺激72 h時最弱（P=0.016）。RPMI、U266和OPM-2細胞則在刺激48、72 h后出現增殖抑制（72 h，P=0.007、0.019、0.002）。低濃度CsA（1、5 μM）刺激OPM-2細胞后，細胞增殖能力同樣隨時間增長不斷減弱；高濃度CsA（10 μM）刺激后，OPM-2細胞增殖能力基本為零。其他細胞系亦出現相同的趨勢，這說明10 μM CsA工作濃度不僅明顯抑制細胞增殖，更能夠引起細胞大量壞死（圖3）。

圖2 10 μM CsA刺激骨髓瘤細胞后ELISA法檢測細胞培養上清中CyPA的濃度（P=0.021，0.014，0.022，0.017）Figure 2 CyPA levels in cell culture supernatant upon CsA stimulation (10 μM)were determined through ELISA

圖3 不同濃度CsA刺激骨髓瘤細胞后CCK-8法檢測細胞增殖能力Figure 3 Cell proliferation of MM cells upon CsA stimulation was determined through CCK-8 assay

PARP蛋白裂解是細胞凋亡早期的動態變化。因此，本研究進一步利用Western blot檢測PARP表達水平來評估CsA刺激對骨髓瘤細胞凋亡的影響。在4種骨髓瘤細胞中，CsA處理均可誘導出裂解狀態的PARP表達；并且隨時間延長，CsA誘導PARP裂解的作用也越強（圖4）。

圖4 10 μM CsA刺激骨髓瘤細胞后Western blot法檢測PARP裂解程度評估細胞增殖能力Figure 4 Cell apoptosis of MM cells upon CsA stimulation(10 μM)was determined through Western blot

3 討論

自Sarris等［6］從牛胸腺細胞中純化獲得CyPA以來，CyPA在細胞生命活動中的重要作用被不斷發現，與腫瘤等多種疾病的密切關系也引起關注。CyPA廣泛分布于多種組織器官，它可被分泌到細胞外，發揮類似細胞因子的功能，或作為CsA的胞內受體介導CsA的免疫抑制作用［4-5］。本研究在前期工作中發現，MM患者外周血和骨髓標本中CyPA濃度均明顯升高，可能與MM的發生和進展密切相關［7］。在此基礎上，本研究對CyPA與MM的關系進行了更加深入的探討發現，MM與其早期階段MGUS和SMM相比，隨著腫瘤從良性到惡性的演變，骨髓中CyPA的濃度逐漸升高，而當患者接受治療后CyPA濃度則明顯下降；體外實驗證實，CsA可作為骨髓瘤細胞中CyPA分泌的抑制劑，抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，提示Cy? PA可能在MM發生、發展中起重要作用，尤其在異型轉變中起關鍵作用。已有多項研究證實CyPA與多種腫瘤密切相關［8］。CyPA在多數NSCLC組織的胞漿和胞核中呈現出強陽性染色。因此，CyPA普遍高表達可能是肺組織惡性轉化的表現；同時NSCLC細胞株中CyPA表達被抑制后，細胞增殖能力和糖代謝水平顯著下降，并且出現明顯的凋亡現象［9］。CyPA也是胰腺癌組織特征性的高表達分子：胰腺癌細胞株和組織中，CyPA和CD147同步高表達；并且高表達的CyPA還能激活ERK1/2和p38信號通路，具有顯著的促增殖作用，并且同時能夠誘導化療抵抗［10］。CyPA還能上調多種耐藥基因的表達，誘導肝癌等腫瘤細胞的化療抵抗，促進腫瘤發展［11-12］。本研究的結果與上述研究結果一致，MM患者外周血和骨髓標本中CyPA濃度均明顯升高，而在治療后明顯下降，與疾病的惡性程度呈正相關；同時CyPA在骨髓中升高的程度更加明顯，可以高達外周血濃度的10倍以上。因此，提示將骨髓CyPA濃度作為評估MM預后的分子標記，同時具有一定的特異性和敏感性，可能具有更加重要的臨床意義。

CyPA是CsA的胞內受體，介導CsA參與的免疫抑制。二者結合后，抑制胞漿中鈣調磷酸酶活化，通過抑制NF-AT去磷酸化和入核、或阻斷MAPK/p38信號通路，下調IL-2和IFN-γ的表達，從而促進T細胞凋亡、抑制T細胞增殖和分化［13-15］。目前，已有研究將上述結論應用于抗艾滋病等免疫缺陷疾病的藥物研究當中［16］。本研究結果顯示，CsA可作為骨髓瘤細胞中CyPA功能的抑制劑，抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，提示靶向CyPA的CsA可能在改善MM預后中做出貢獻。無免疫抑制作用的CyPA抑制藥物具有強大的潛在應用前景，已有多種類似藥物處于被研究和開發階段。Alisporivir（Debio025）是最先被投入Ⅲ期臨床試驗的CyPA抑制劑，與IFN-γ聯用具有高效的抗病毒作用［17］。另外兩個 CsA衍生物NIM811［18-19］、MM218［20-21］也在急性肺損傷、關節炎和心肌再灌注損傷中被證實具有顯著的抗炎癥作用。但目前尚無有關上述藥物在MM中的應用研究，本課題組已經收到由Gunter Fischer教授饋贈的MM218試劑，后續實驗中將對MM218通過抑制CyPA治療MM的潛在作用進行深入的探討。

綜上所述，隨著MM惡性程度的增加，骨髓中Cy?PA濃度顯著升高，經治療緩解后CyPA濃度顯著下降，其介導的細胞增殖在MM的致癌機制中起到關鍵作用。CsA作為CyPA作用的抑制劑，具有促進細胞凋亡、阻礙細胞增殖的作用，無免疫抑制作用的CsA衍生物，可能是潛在高效的MM治療手段。上述研究發現為臨床工作中MM的診斷和預后評估提供新的思路，但具體機制和應用價值還有待進一步研究。

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（2016-11-21收稿）

（2017-01-06修回）

（編輯：孫喜佳 校對：楊紅欣）

Cyclophilin A-targeted cyclosporin A inhibits cell proliferation in multiple myeloma

Minghan QIU1,Zhongqiu WANG1,Xiaojie LIU1,Kumar.SHAJI2,Zhiyong YUAN1

Zhiyong YUAN;E-mail:dryuantj@163.com
1Department of Radiation Oncology and Cyberknife Center,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Clinical Research Center for Cancer,Tianjin 300060,China;2Division of Hematology,Mayo Clinic,Rochester 55905,USA This work was supported by the Foundation of Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital(No.B1512)

Objective:Cyclophilin A(CyPA),a member of the cyclophilin family,is highly expressed in a variety of malignancies and plays an important role in tumorigenesis.In this study,bone marrow expression of CyPA in patients with multiple myeloma(MM)and the effects of CyPA on the proliferation and apoptosis of myeloma cells are studied.Methods:ELISA assay was used to detect the CyPA levels in bone marrow specimens and cell culture supernatant.CCK-8 assay and Western blot were used to detect cell proliferation and apoptosis upon cyclosporin A(CsA)stimulation.Results:Compared with the early-stage monoclonal gammopathies of undetermined significance(MGUS)and smoldering myeloma(SMM),the level of bone marrow CyPA was significantly increased in patients with MM and decreased after treatment.Upon CsA stimulation,CyPA secretion was inhibited in the supernatant of myeloma cells,accompanied by suppressed cellular proliferation and promoted apoptosis.Conclusion:CyPA expression in bone marrow increases significantly with the increase of the malignant degree of MM,indicating that cellular proliferation mediated by CyPA may play a key role in the carcinogenesis of MM.CsA as an inhibitor of CyPA promotes cell apoptosis and suppresses cell proliferation.Thus,the nonimmunosuppressive derivatives of CsA are potentially efficient in MM therapy.

multiple myeloma,cyclophilin A,cyclosporin A,cell proliferation,apoptosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.04.347

①天津醫科大學腫瘤醫院放射治療科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心（天津市300060）；②美國梅奧診所血液科

*本文課題受天津醫科大學腫瘤醫院引進人才與博士啟動基金項目（編號：B1512）資助

袁智勇 dryuantj@163.com

邱鳴寒 專業方向為惡性腫瘤的放射治療。

E-mail：qiuminghan@163.com