代謝型谷氨酸受體4的真核表達及其在乳腺癌細胞增殖中的作用

肖斌，陳麗丹，孫朝暉，廖揚，杭建峰，陳建蕓，張蓉，李林海

廣州軍區廣州總醫院 檢驗科，廣東 廣州 510010

代謝型谷氨酸受體4的真核表達及其在乳腺癌細胞增殖中的作用

肖斌，陳麗丹，孫朝暉，廖揚，杭建峰，陳建蕓，張蓉，李林海

廣州軍區廣州總醫院 檢驗科，廣東 廣州 510010

目的：建立代謝型谷氨酸受體4（mGluR4）在乳腺癌細胞MCF-7中高表達的模型，探索mGluR4的亞細胞定位及其在乳腺癌增殖中的作用。方法：提取MCF-7細胞總RNA并逆轉錄為cDNA；PCR擴增mGluR4基因；利用無縫克隆技術快速構建以pENTER為載體的mGluR4重組表達質粒；通過Western印跡和免疫熒光實驗檢測mGluR4在MCF-7細胞中的表達及定位；利用CCK8實驗觀察mGluR4對MCF-7細胞增殖的影響。結果：構建了能夠在MCF-7細胞中高表達的mGluR4真核表達質粒，免疫熒光結果顯示mGluR4定位于細胞膜和細胞質，CCK8實驗表明高表達mGluR4顯著促進乳腺癌細胞的增殖能力。結論：為探索mGluR4的相關功能制備了必要工具，為研究mGluR4在乳腺癌增殖中的分子機制奠定了基礎。

代謝型谷氨酸受體4；乳腺癌；真核表達；增殖

谷氨酸鹽是中樞神經系統重要的興奮性神經遞質，它通過與細胞膜表面的離子型受體（ionotropic glutamate receptors，iGluR）和代謝型受體（metabotropic glutamate receptors，mGluR）結合，調控胞內信號通路傳導，引起一系列生理或病理學效應[1]。mGluR家族屬于G蛋白偶聯受體，由8個成員組成。根據不同氨基酸序列的相似性及偶聯蛋白的類型，可將這8種亞型分為3組：Ⅰ組包括mGluR1和mGluR5，與Gq偶聯；Ⅱ組包括mGluR2和mGluR3，與Gi和Go偶聯；Ⅲ組包括mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8，與Gi和Go偶聯。mGluR與膜內G蛋白偶聯，通過G蛋白介導的胞內第二信使信號傳導，產生慢生理反應，在離子通道調節、神經元興奮與神經遞質釋放等方面發揮重要作用[2]。

盡管mGluR在神經系統中的研究已較為詳盡，但是其在腫瘤發生發展過程中的作用機制仍然不清楚。研究表明，mGluR的配體——谷氨酸鹽能夠促進前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，這一進程可能與谷氨酸鹽和mGluR的結合有關[3]。在mGluR各亞型中，對mGluR5在腫瘤中的作用的研究最為詳盡。mGluR5高表達于鱗狀上皮細胞癌，抑制其表達能夠減緩腫瘤生長[4]；另外，肝臟組織特異性表達mGluR5，而不表達與其同組的mGluR1。mGluR5通過MAPK/ERK通路促進肝癌細胞的遷移和侵襲能力[5]。然而，mGluR4在腫瘤發生發展中扮演的角色仍然是未知數。mGluR4是適應性免疫的重要調節因子[6]，其基因的多態性與骨肉瘤的敏感性及發展進程密切相關[7-9]。基于mGluR4的前期研究報道及mGluR各亞型在多種腫瘤進程中的作用，我們推測mGluR4可能在腫瘤增殖過程中發揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細胞MCF-7購自中國科學院上海細胞庫；大腸桿菌TOP10感受態細胞購自天根生化（北京）有限公司；pENTER真核表達質粒購自山東維真生物科技有限公司；Total RNA KitⅠ購自Omega Bio-Tek公司；質粒小抽試劑盒及2×PCR預混液購自Biotool公司；First-Strand cDNA Syn?thesis Supermix購自北京全式金生物有限公司；MluⅠ內切酶購自寶生物（大連）有限公司；AsiSⅠ內切酶購自北京NEB公司；One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司；X-treme?GENE HP DNA Transfection Reagent購自Roche公司；mGluR4抗體購自Abcam公司；抗Flag標簽抗體、羊抗鼠HRP標記二抗、羊抗兔HRP標記二抗購自Bioworld公司；綠色熒光標記的羊抗兔二抗及DAPI購自Thermo fisher公司；CCK8試劑盒購自日本同仁化學研究所。

1.2 總RNA的提取及逆轉錄

按照試劑盒操作步驟從3×106MCF-7細胞中抽提總RNA；以總RNA為模板，用First-Strand cDNA Synthesis Supermix試劑盒合成cDNA第一鏈［①配制逆轉錄反應體系：RNA模板500 ng，Oligo（dT）18（0.5 μg/μL）1 μL，2×ES Reaction Mix 10 μL，RT/RI酶混合液1 μL，加入無RNA酶水至總體積20 μL；②輕輕混勻，42℃孵育30 min；③85℃加熱5 s失活RT/RI酶］。

1.3 基因擴增及重組質粒構建

質粒構建策略采用最新的快速無縫克隆技術（諾唯贊公司）。首先，根據試劑盒要求設計mGluR4基因（Pubmed ID：NM_000841）的特異性上游引物（AGGAGATCTGCCGCCGCGATCGCA TGCCTGGGAAGAGAGGCTTG，黑體部分為載體序列，下劃線為AsiSⅠ酶切位點，斜體部分為基因序列）和下游引物（CTCGAGCGGCCGCGTACGCGTGA TTGCATGGTTGGTGTAAG，黑體部分為載體序列，下劃線為MluⅠ酶切位點，斜體部分為基因序列）。PCR擴增條件：98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃15 s，共32個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測大小并對特異性單一條帶進行割膠回收。將純化的DNA片段與線性化的pENTER真核表達質粒（酶切位點：AsiSⅠ和MluⅠ）進行無縫克隆連接，連接產物轉入大腸桿菌TOP10感受態細胞，將菌液涂布在含卡那霉素（Kan+）的平板上過夜培養，挑取單克隆菌落，過夜振蕩培養后提取質粒，利用雙酶切鑒定及測序驗證插入序列無誤后，質粒用于后續實驗。

1.4 質粒轉染及Western印跡

將1.2×107MCF-7細胞鋪于6孔板中的4個孔，每孔約3×106細胞。待細胞長至80%的匯合度后，按照轉染步驟每孔轉入2 μg mGluR4重組質粒或空載體，分別于24、36和48 h收集并裂解細胞（空質粒轉染細胞于24 h收集），隨后進行SDS-PAGE（濃縮膠：80 V，30 min；分離膠：100 V，60 min；轉膜條件：恒流180 mA，140 min）。配制5%脫脂牛奶封閉PVDF膜，室溫1 h；加入1∶100稀釋的mGluR4抗體，室溫孵育2 h，用TBST溶液洗膜4次，每次5 min；加入1∶10000稀釋的羊抗兔二抗（HRP標記），室溫孵育1 h，用TBST溶液洗膜4次，每次5 min；配制ECL發光液并滴加在膜上，隨后用Sage Creation公司的化學發光成像儀（MINICHEMI）進行顯影曝光。

1.5 免疫熒光

質粒轉染步驟同上，區別在于須在6孔板底部放置一張蓋玻片，便于細胞爬片。質粒轉染36 h后棄掉細胞培養上清，用PBS清洗2次，并加入4%多聚甲醛溶液500 μL，室溫固定15 min；棄上清，用PBS清洗2次，加入500 μL 0.25%的Tri?ton X-100，室溫靜置10 min；棄上清，用PBS清洗4次，加入500 μL PBST（1%BSA，0.1%Tween，溶于PBS中）封閉30 min；棄封閉液，每孔以1∶100的比例加入mGluR4抗體，4℃封閉過夜；用PBS洗滌3次，以1∶1000的比例加入羊抗兔綠色熒光二抗，室溫避光孵育90 min；用PBS洗滌細胞3次，滴加DAPI工作液，室溫避光孵育10 min；用冰冷的PBS洗滌1次，用抗熒光淬滅封片劑封片并用激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.6 CCK8實驗

質粒轉染步驟同上，區別在于每孔分別轉染0.5、1、2、3 μg重組質粒及0.5 μg空載體。48 h后，將轉染的細胞傳代至96孔板中，每孔約1×104細胞，體積100 μL；待細胞貼壁后，每孔加入10 μL CCK8工作液，37℃、5%CO2孵育2 h。用酶標儀測定D450nm值。本實驗重復3次。

2 結果

2.1 mGluR4的基因擴增及重組質粒構建

以MCF-7細胞的cDNA為模板進行PCR擴增，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果如圖1A，擴增出的單一條帶大小約為2700 bp，與mGluR4基因（2739 bp）相近。將該條帶進行割膠純化，并與線性化的pENTER載體直接進行連接反應，轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞后涂板培養，挑單克隆菌落振蕩培養后提取質粒，經AsiSⅠ和MluⅠ酶切鑒定，重組質粒被切成2段，大片段為線性化載體，小片段為插入基因mGluR4（圖1B）。質粒送華大公司測序驗證，經序列比對后證實插入序列無誤，表明重組質粒構建成功。

2.2 mGluR4在乳腺癌細胞MCF-7中的表達

2 μg重組質粒轉染至80%匯合度的MCF-7細胞中，空載體轉染組為陰性對照。轉染后24、36、48 h分別收集并裂解各組細胞樣本進行Western印跡檢測，一抗使用抗Flag標簽抗體。在不同時間點均檢測到了Flag-mGluR4的表達（圖2），而空質粒轉染組沒有發現相應的條帶，表明重組Flag-mGluR4蛋白表達成功。

2.3 mGluR4的亞細胞定位

Gene Ontology（GO）預測mGluR4為7次跨膜蛋白，可能定位于細胞膜或細胞質（http://www.uni?prot.org/uniprot/Q14833#subcellular_location）。另有研究表明，mGluR4的mRNA廣泛見于人的丘腦、下丘腦和尾狀核，并高表達于小腦粒細胞[10]。但mGluR4在腫瘤細胞中的定位仍不清楚。為了探索mGluR4在乳腺癌細胞中的定位，我們將重組質粒轉染MCF-7細胞，36 h后固定細胞并用抗mGluR4抗體檢測蛋白的亞細胞定位。令人驚訝的是，mGluR4除了定位于已知的細胞膜外，還分布于細胞質中，而對照組無熒光表明實驗組的熒光為特異性表達（圖3）。mGluR4在乳腺癌細胞中的這種有趣的分布，為我們進一步研究其分子機制提供了線索。

圖1 mGluR4重組質粒的構建

圖2 轉染后mGluR4真核表達質粒在乳腺癌細胞MCF-7中的表達

2.4 mGluR4在乳腺癌細胞增殖中的作用

為了證實mGluR4在乳腺癌細胞增殖中的作用，我們將不同濃度的重組質粒（空載體0.5 μg，重組質粒0.5、1、2、3 μg）分別轉染至6孔板中培養的MCF-7細胞，48 h后將細胞傳代至96孔板中，利用CCK8實驗檢測細胞增殖活性。結果如圖4，細胞增殖活力（D450nm）隨著質粒轉染濃度的增加而增強，并且實驗組細胞的增殖能力顯著高于對照組。

圖3 mGluR4的亞細胞定位

圖4 mGluR4促進乳腺癌細胞的增殖

3 討論

谷氨酸鹽受體是神經信號傳遞的重要樞紐，廣泛參與神經元調節、軸突發育及突觸可塑性形成等正常及病理狀態下的大腦神經活動，而mGluR是其重要的分支之一。mGluR通過胞內段偶聯的G蛋白傳遞分子信號，激活第二信使產生，從而導致細胞代謝發生改變。盡管mGluR在神經系統中的作用機制已研究得較為詳盡，但其在腫瘤，尤其是乳腺癌發生發展中的作用還有待發現。前人的一些研究為本文的實驗設計提供了依據：Venneti等利用正電子發射斷層掃描技術（PET）發現谷氨酸示蹤劑可以被神經膠質瘤吸收來輔助其生長，而不會被周圍健康組織吸收[11]，這一現象可能與谷氨酸鹽受體在神經膠質瘤中的高表達有關[12]；而細胞分泌的谷氨酸能通過MAPK和PI3k/Akt通路促進黑色素瘤和神經膠質瘤的增殖和轉移[13-14]；更直接的證據表明mGluR4也可以激活MAPK/ERK通路促進神經元祖細胞的增殖[15]。經過科學推測及實驗證實，我們首次發現mGluR4能夠促進乳腺癌細胞的增殖能力。

本研究還發現了另一個有趣的現象，即mGluR4廣泛分布于乳腺癌細胞的細胞膜和細胞質內。根據GO分析所得mGluR4的拓撲結構及其跨膜屬性，我們預測mGluR4可能同樣分布于一些細胞內膜上；而mGluR4在細胞內膜中的功能仍有待發現，這也是本課題組未來的研究方向之一。

總之，我們構建并表達了mGluR4真核表達質粒，分別利用激光共聚焦顯微鏡和CCK8試劑觀察了mGluR4的亞細胞定位及其在乳腺癌增殖中的作用，這就為研究mGluR4的分子機制制備了有效的工具，為探索mGluR4在乳腺癌中的生物學功能奠定了基礎。

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Eukaryotic Expression of mGluR4 and its Role in the Pro?liferation of Breast Cancer Cell

XIAO Bin,CHEN Li-Dan,SUN Zhao-Hui,LIAO Yang, HANG Jian-Feng,CHEN Jian-Yun,ZHANG Rong,LI Lin-Hai*
Department of Laboratory Medicine,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA,Guang?zhou 510010,China

Objective:To express metabotropic glutamate receptor 4（mGluR4）in breast cancer cell line MCF-7, further explore the subcellular localization and the role of mGluR4 in cell proliferation.Methods:The total RNA was extracted from MCF-7 cells and was subsequently reversed into cDNA,and from which,mGluR4 gene was amplified by PCR.Recombinant mGluR4 expression plasmid was constructed using one step cloning kit.Western blotting and immunofluorescence assays were applied to detect the expression and localization of mGluR4 respec?tively.The effect of mGluR4 on the proliferation of MCF-7 was also measured.Results:The mGluR4 was local?ized in the cytoplasm and membrane of MCF-7 cells.The expression of mGluR4 could significantly enhance the proliferation of breast cancer cells.Conclusion:This research will provide a useful tool for studying the function of mGluR4 and lay the foundation of the molecular mechanism of mGluR4 in the proliferation of breast cancer.

metabotropic glutamate receptor 4;breast cancer;eukaryotic expression;proliferation

Q78

A

1009-0002（2017）02-0109-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.008

2016-09-29

2015年廣州市科創委項目（201604040003）

肖斌（1986-），男，博士

李林海，（E-mail）mature303@126.com

*Corresponding anthor,E-mail:mature303@126.com