蛋白質組學技術及其在藥物成癮研究中的應用

朱貝貝，李翔宇，陳歡，張森，侯宏衛，胡清源

國家煙草質量監督檢驗中心，河南 鄭州 450001

蛋白質組學技術及其在藥物成癮研究中的應用

朱貝貝，李翔宇，陳歡，張森，侯宏衛，胡清源

國家煙草質量監督檢驗中心，河南 鄭州 450001

概述了蛋白質組學技術中分離、鑒定和定量方法及其在致癮性藥物（如酒精、煙堿、嗎啡、可卡因和安非他命）研究中的應用。蛋白質組學技術是繼后基因組學技術的一大重要突破。隨著蛋白質分離、鑒定及定量技術的進步，尤其是覆蓋范圍廣、分離效率高的液相色譜技術和高靈敏度質譜技術的發展，使得蛋白質組學越來越廣泛地應用于藥物成癮研究，將有助于了解藥物依賴過程中蛋白質的變化及其參與的生物過程和相關通路，理解藥物成癮的分子機制。

蛋白質組學；分離鑒定；定量蛋白質組學；藥物成癮

蛋白質組（proteome）的概念是由澳大利亞科學家Wilkins和Williams在1994年意大利科學會議上首次提出的，指基因組表達的所有相應蛋白質，即細胞、組織或機體存在的全部蛋白質及其活動形式[1]。蛋白質組學能夠從整體角度動態分析細胞內蛋白質的組成、表達水平、修飾狀態、生物功能及參與的生物過程和蛋白質之間的相互作用與聯系規律。蛋白質組學技術已廣泛應用于生物醫學各個領域。藥物成癮是一種不正常的強迫性行為，盡管使用者知道這類藥物的嚴重后果，但仍不能控制這些藥物的使用。研究表明，反復接觸致癮性藥物（如酒精、煙堿、嗎啡和可卡因等）可以改變腦部特定區域蛋白質的表達水平和表達類型，這種表達的改變將介導個體神經元及其相關的神經通路，并由此可能產生與成癮相關的異常行為[2]。因此，鑒定形成和維持成癮相關的蛋白質是理解成癮潛在分子機制的關鍵。蛋白質組學能夠整體衡量藥物成癮過程中蛋白質組的動態變化（圖1）。后續的生物信息學分析如基因本體注釋（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路注釋使得藥物成癮過程中蛋白質參與的生物學過程和相關通路更加清晰，因此可以增加對藥物成癮過程的理解，普遍適用于藥物成癮的研究。

圖1 藥物成癮中蛋白質組學研究的技術路線

早期蛋白質組學（proteomics）是指采用雙向凝膠電泳和質譜等技術分離和鑒定蛋白質，并用生物信息學的方法建立相關數據庫來研究某一基因組表達的所有蛋白質及蛋白質之間的相互作用[3]。隨著自下而上鑒定蛋白質裂解產物技術的發展，液相色譜分離技術和質譜鑒定技術逐漸應用于蛋白質組學的研究。蛋白質組學的發展有賴于分離、鑒定及定量技術的進步，尤其是覆蓋范圍廣、分離效率高的液相色譜技術和高靈敏度的質譜技術的發展[4]。

1 蛋白質樣品的分離

復雜的蛋白質樣品需要經過進一步的分離，蛋白質樣品分離的主要技術包括凝膠電泳和非凝膠液相色譜兩大類，2種分離技術已廣泛應用于藥物成癮蛋白質組學的研究（表1）。

1.1 雙向凝膠電泳分離技術

蛋白質分離的傳統技術主要是凝膠電泳，其原理是蛋白質在高壓電場作用下首先根據蛋白質的等電點進行第一向等電聚焦分離，然后根據蛋白質的相對分子質量進行第二向聚丙烯酰胺凝膠分離。Song[10]等利用凝膠電泳分離技術研究了嗎啡耐受性大鼠脊髓中蛋白激酶C（PKC）相關蛋白質的表達，結果顯示嗎啡耐受性大鼠和未基因敲降PKC正常大鼠脊髓中存在13種差異表達的蛋白質，第一次發現肌成束蛋白（FSCN）參與嗎啡耐受性的調控。Saeideh[11]等基于此分離技術研究了嗎啡依賴大鼠海馬組織中蛋白質的表達，結果顯示鑒定出的差異蛋白質可能通過調節海馬神經元可塑性，誘導記憶障礙和嗎啡依賴。用凝膠電泳分離技術分析鑒定的蛋白質并未充分涉及藥物成癮調控中發揮重要作用的關鍵蛋白質，如成癮藥物與神經相互作用的神經受體如乙酰膽堿受體，阿片肽受體和大麻素受體及調控遞質釋放的多巴胺、谷氨酰胺和氨基丁酸受體[12-13]。可能是因為在藥物成癮過程中這類蛋白質屬于低豐度蛋白質，易被高豐度蛋白質掩蓋，而凝膠電泳分離技術不易分離這類蛋白質。

表1 蛋白質分離技術的比較

1.2 非凝膠液相色譜分離技術

1.2.1 一維液相色譜分離技術 液相色譜分離效率高、分析速度快且重現性好，易于實現與質譜的自動聯用[14]。對于簡單的樣品體系，單維色譜因其操作簡單，易于自動化，在蛋白質組學研究中發揮了重要作用[15]。在實際操作中，由于色譜系統反壓過高，限制了超高壓液相色譜在蛋白質組學研究中的廣泛應用。許多蛋白質和肽的含量極低，需要高靈敏度的質譜儀才能檢測，穩定高效的液相色譜分離技術將支持此微量樣品的檢測[16]。Bosch[6]基于納升液相色譜分離技術鑒定出安非他明誘導的大鼠紋狀體突觸區雙載蛋白、內吞蛋白B2、過渡ER腺苷三磷酸酶、B亞組V型質子腺苷三磷酸酶差異表達，這些差異表達的蛋白質在囊泡產生、激活和運輸中具有重要作用。Wearne[17]等基于此技術鑒定出安非他明誘導敏化大鼠前額皮質區γ-氨基丁酸A型受體（GABAA）、多巴胺D2受體相關的橋尾蛋白（GPHN）、脂肪酸結合蛋白3（FABP3）、鈣離子水平相關的人視錐蛋白1（VSNL1）和鈣調磷酸酶（PPP3R1）差異表達，研究表明多巴胺D2受體可能通過下游調節細胞內鈣離子的水平，進而影響動物體的能量代謝、信號傳導和多巴胺合成，導致生物體產生長期沮喪和認知功能紊亂。用一維分離技術鑒定出一些與成癮藥物作用受體相關的蛋白質[16-17]，但一維色譜由于其分辨率和峰容量有限，對復雜的蛋白質樣品仍難以實現完全分離。

1.2.2 多維液相色譜分離技術 多維液相色譜分離技術是將2種或多種分離技術聯合起來構建的分離平臺，整個分離系統分離容量顯著提高。理論上如果每一維的分離機理完全不同，即具有正交的分離機理，則系統可獲得最大的峰容量n= ninj...[18]。Stockton[7]等基于二維分離技術研究了嗎啡暴露組和對照組大鼠紋狀體突觸密集區蛋白質表達的變化，結果顯示G蛋白偶聯受體、蛋白降解和泛素化修飾等相關差異表達的蛋白質可能在阿片類藥物成癮中發揮重要作用。Oever[8]等基于二維液相色譜分離技術研究了海洛因復吸大鼠前額皮質蛋白質的表達，鑒定出與復吸易感性相關的神經遞質分泌蛋白和基質膜蛋白差異表達，基質膜蛋白凝聚在氨基丁酸圍繞的神經網絡上，此改變可能激活氨基丁酸神經網絡，進一步影響海洛因的復吸。基于高通量多維液相分離技術在藥物成癮蛋白質組學的研究中鑒定到神經遞質釋放、氨基丁酸相關蛋白質，進一步推動了藥物成癮蛋白質組學的研究。但多維液相色譜分離技術分析樣品的速度較慢，盡管已有超高壓液相色譜，但總體來說分離速度受到限制[19]。

1.2.3 高通量多維陣列液相色譜分離技術 多維陣列液相色譜是將多維色譜做成陣列式，“陣列”代表著多通道和同時分離，可以縮短多維液相色譜的分離時間。多維陣列式液相色譜技術能夠實現高通量、高效率的分析，已逐漸應用于蛋白質組學的研究。Huang[9]等基于此技術研究了人的血漿樣品，將分析時間由原來的1周縮短到4 h，鑒定蛋白質的濃度范圍達9個數量級。高通量、高效率的多維陣列分離技術也將逐漸應用于藥物成癮蛋白質組學的研究。

表2 質譜鑒定技術比較

2 蛋白質樣品的鑒定

質譜技術的發展為蛋白質鑒定提供了快速、準確的分析方法。質譜鑒定技術的進步之一是軟電離技術的發現，這大大方便了生物樣品中蛋白質和肽的鑒定。軟電離技術主要包括2種基質輔助激光解吸電離（MALDI）[20]和電噴霧離子源（ESI）電離[21]。在藥物成癮應用中MALDI通常與飛行時間質譜（TOF）結合使用，ESI電離技術通常與軌道離子阱（Orbitrap）、離子阱（IT）、四級桿（Q）和傅里葉變換離子回旋加速（FT-ICR）結合使用（表2）。

2.1 MALDI-TOF鑒定技術

飛行時間質譜是較早時期能夠高精度測試質量的手段之一，MALDI通常與TOF質量檢測器結合使用，主要應用于自上而下的蛋白質組學。TOF以脈沖的模式實現離子的分離，通過測量每個離子在真空管中的飛行時間推導分析物的質量。Gorinic[23]基于MALDI-TOF和MALDI-TOF/ TOF技術研究慢性酒精戒斷小鼠大腦皮質蛋白質表達的變化，鑒定到內吞和能量相關的肌動蛋白1差異表達，結果表明藥物成癮可能導致腦部適應性的變化和腦部重塑。MALDI-TOF廣泛應用于藥物成癮蛋白質組學的研究，但此技術與上游兼容的技術聯合使用很難鑒定成癮中低豐度和極性蛋白質，且重復性差。

2.2 ESI-Orbitrap鑒定技術

軌道阱質譜是利用離子在特定靜電場中運動頻率的不同對離子進行質量分析，此技術不僅可以獲得更好的數據質量，而且峰容量增加，從而可以檢測更多低分辨率的信號[30]。Uys[26]等基于此鑒定技術研究了酒精誘導小鼠伏隔核突觸密集區蛋白質表達的變化，結果表明59種差異表達的蛋白質中大多數蛋白質主要參與細胞形態的調節。Orbitrap能夠提供蛋白質翻譯后的信息，但相對于離子回旋質譜其分辨率略低。

2.3 ESI-TQ鑒定技術

離子阱是離子源產生的離子以脈沖的形式進入離子阱，從而實現高通量質量分析[27]。Lai[28]基于此質譜技術鑒定了酒精戒斷者血液中潛在的生物標志物，結果標明女性中載脂蛋白C1和D及男性中載脂蛋白M和谷胱甘肽過氧化物酶等可做為酒精成癮戒斷者潛在的生物標志物。然而它的分辨率、離子捕獲能力低和質量測量結果的準確性相對有限。

2.4 ESI-Q鑒定技術

四級桿具有高靈敏度和廣泛的檢測范圍，通常與其他質譜串聯用于蛋白質組學研究。Mi?chalski[29]基于Q-Orbitrap在90 min梯度時間內鑒定了胰蛋白酶消化的哺乳動物細胞裂解物中超過2500個蛋白質。據了解，此技術尚未應用于藥物成癮蛋白質組學的研究。

2.5 ESI-FT-ICR鑒定技術

FT-ICR的分辨率和精確度是質譜技術的重要突破，在蛋白質組學的研究中可精確鑒定一些低豐度的蛋白質及蛋白質翻譯后的修飾。傅里葉變換回旋加速須在較高的磁場下進行，儀器操作復雜且費用較高[30]。此技術憑借其高的分辨率和精確度將有助于藥物成癮蛋白質的鑒定。

3 定量蛋白質組學技術

精確、可重復的定量蛋白質組學方法能夠揭示蛋白質水平上相對小的變化，這些微小變化可能導致細胞表型或細胞信號的重大變化[31]。用于蛋白質定量的非凝膠方法包括非標定量法（lable-free）、同位素代謝標記（SILAC）、同位素親和標簽法（ICAI）、重同位素標簽標記定量法（iTRAQ）[32]，如表3。

表3 蛋白組學定量方法的比較

3.1 非標定量技術

非標定量方法包括頻譜計數和提取離子色譜圖（XIC）2種。頻譜計數依賴于所有蛋白質相應肽段的測序次數，蛋白質的豐度越高，較多數量的肽可用于測序，從而形成更多的MS/MS數。提取離子色譜圖根據三圍空間中肽離子的強度、m/z和色譜保留時間來定量。XIC的準確度高，更適合于中等豐度蛋白質的定量[37]。Sari[33]等基于非標定量技術研究了酒精誘導小鼠大腦蛋白質表達的變化，鑒定到對腦發育具有重要作用的抑制素和神經元遷移蛋白質顯著下調。Bosch[6]等也基于此技術研究了安非他明誘導大鼠紋狀體蛋白質的表達。非標定量蛋白質組學具有相對寬的動態范圍，而且可以定量多個樣品，但其精確度低、可重復性差，很難檢測到低豐度蛋白質，且對儀器的精密度要求較高[41]。

3.2 SILAC定量技術

SILAC原理很簡單：2組細胞同時培養時，A組在包含正常氨基酸（light）的培養基中，B組則在含有“重型（heavy）”氨基酸的培養基中，即穩定同位素標記的氨基酸。細胞傳若干代后，穩定同位素標記的氨基酸完全摻入蛋白質中，取代了原有的氨基酸。這樣，2個蛋白質之間就存在分子量的改變，而其化學性質無變化。SILAC定量方法簡單，但僅適用于活體研究，且周期較長[39]。據了解在藥物成癮中沒有應用。

3.3 ICAI定量技術

ICAT對含有L2半胱氨酸的巰基蛋白質或肽段樣品分別予以輕、重標記。由于ICAT在化學結構上相同且在相對分子質量上相差8個中子，所以用MS檢測時相對定量的可信性有所提高[40]。Morón[34]等基于ICAT研究了嗎啡誘導組和正常組小鼠海馬突觸后密集區蛋白質表達的差異，結果顯示差異表達的蛋白質可能通過調節突觸上內吞蛋白的重組，進而誘導海馬谷氨酸受體突觸可塑性。Prokai[35]等也基于此技術鑒定了嗎啡誘導大鼠前額皮質突觸膜蛋白的變化。近期藥物成癮蛋白質組學的研究很少使用此技術進行定量分析。ICAT標記的效率具有時間依賴性，且只能標記半胱氨酸或其巰基被修飾的蛋白質，標記效率很少能達到80%以上，輕、重試劑標記的多肽有可能在不同的時間洗脫，所以其相對定量結果可能出現假陽性[41]。

3.4 iTRAQ定量技術

iTRAQ定量技術通過4個或8個來源不同的相同蛋白質樣品在一級質譜上表現相同，平衡基團在二級質譜中發生中性丟失，報告基團在二級質譜中產生4個或8個報告離子，分析報告離子峰的比值強度，及同一個蛋白質在不同樣品間表達量的比值。該技術分析能力強、范圍廣，可用于低豐度、強堿性、相對分子質量小于10×103或大于200×103的蛋白質的檢測，定量分析可靠[42]。Reissner[36]等基于此定量技術鑒定了可卡因誘導大鼠伏隔核突觸后密集區蛋白質表達的變化，結果表明突觸上的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）谷氨酸受體表面的GluR1差異表達，這些差異表達的蛋白質可能通過增加NAC上的AMPA受體的表達誘導可卡因的復吸。但iTRAQ技術樣品預處理和酶解過程可能引起平行樣品之間的差別，造成結果偏差，且成本較高。

4 結語

蛋白質組學能夠動態分析細胞內變化蛋白質的組成、表達水平和生物功能，及參與的生物過程、蛋白質之間的相互作用和聯系規律。蛋白質組學技術已廣泛應用于生物醫學各領域如腫瘤、癌癥和致癮性藥物等研究中。反復接觸致癮性藥物可以改變腦部特定區域蛋白質的表達水平或表達類型，新的蛋白質組學技術將逐漸應用于藥物成癮的研究。

從凝膠電泳到多維液相色譜的分離技術已應用于藥物成癮蛋白質組學的研究，鑒定出能量代謝、細胞組織結構、信號傳導、突觸和受體等相關的蛋白質。但實現神經組織中復雜全蛋白質樣品的分離仍是當前研究的熱點。高通量的多維液相色譜分離技術可以進一步實現對全蛋白質的深入分析。

分離技術的進步推動了質譜技術的快速發展，多標記、蛋白質覆蓋率全的定量蛋白質組學技術的進步，也加快了新的質譜技術的發展。由傅立葉變換程序的計算機和磁場捕獲離子的分析室組成的傅立葉變換離子回旋共振質譜儀具有很高的分辨率（可達100萬以上）和靈敏度。

高效快速的分離技術、多標記和覆蓋率全的蛋白質定量技術結合高分辨率和靈敏度的質譜技術，有望提高藥物成癮蛋白質樣品檢測的通量、靈敏度及分辨率。篩選出調控成癮的重要蛋白質，構建藥物成癮相關蛋白質的調控網絡，對于理解藥物成癮的機制及尋找治療藥物成癮的靶標具有重要的研究價值和實際意義。

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Application of Proteome Techniques in Drug Addiction Re?search

ZHU Bei-Bei,Li Xiang-Yu,CHEN Huan, ZHANG Sen,HOU Hong-Wei*,HU Qing-Yuan*
China National Tobacco Quality Supervision&Test Centre,Zhengzhou 450001,China

This paper briefly outlined the separation,identification and quantification proteomics technology and its application in research of addictive drugs like alcohol,nicotine,morphine,cocaine and methamphetamine.Pro?teomics is one of the powerful tools in the post-genomic era.With the development of protein separation,identifi?cation and quantitative technology,especially the liquid chromatography with wide application range and good sepa?ration efficiency and the mass spectrometry with high sensitivity,proteomics has been applied to drug addiction re?search more extensively,and will promote the understand of protein changes during the drug dependence formation and its participation in the biological process and related pathways,which will help to highlight molecular mecha?nisms underlying addiction.

proteomics;peparation and identification;quantitative proteomics;drug addiction

R964

A

1009-0002（2017）02-0207-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.02.028

2016-08-25

國家煙草專賣局重點項目（110201402037）

朱貝貝（1991-），女，碩士研究生

侯宏衛，（E-mail）qsfctc@163.com；胡清源，（E-mail）huqy1965@163.com

*Co-corresponding anthors,HOU Hong-Wei,E-mail:qsfctc@163.com;HU Qing-Yuan，E-mail:huqy1965@163.com