青枯雷爾氏菌胞外多糖研究進展

陳德局，張海峰，劉　波，朱育菁，鄭雪芳，陳小強

(福建省農業科學院農業生物資源研究所　350003)

微生物多糖是細菌、真菌、藍藻等微生物在代謝過程中合成的生物高聚物，主要以3種形式存在： 粘附在細胞表面上，即胞壁多糖;分泌到培養基中，即胞外多糖; 構成細胞的成分，即胞內多糖。廣義上的胞外多糖指的是糖被，包括微莢膜、莢膜、黏液層和菌膠團[1]。病原微生物的胞外多糖被認為是一種致病因子，越來越受到科研工作者的重視[2-3]。銅綠假單胞菌是人和動物的機會致病菌，它合成的大量胞外多糖是形成生物膜的重要組分，其形成生物膜后對藥物具有更高閾值的抗藥性，給病人抗感染治療增加難度[4-5]。Baker等[6]通過抑制銅綠假單胞菌的胞外多糖形成生物膜，能顯著提高細菌對藥物的敏感性，提出針對胞外多糖形成生物膜的治療銅綠假單胞菌的感染策略。在植物病原菌中，合成胞外多糖形成外夾膜可以逃避宿主免疫系統識別，并防止自身水分和養分的丟失[7]，也可以促進微生物在寄主內形成生物膜而獲得群體性的生存優勢[8]。

青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)是植物細菌性青枯病的致病菌，具有破壞性的土傳性植物病原菌，地理分布廣泛，寄主范圍廣，可侵染50多個科的200多種植物[1，9]。青枯雷爾氏菌在營養豐富的環境，能合成胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)分泌到細胞壁外，有的胞外多糖分泌到胞外后依附于微生物細胞壁形成莢膜，稱為莢膜多糖；有的胞外多糖分泌到胞外后進入培養基形成粘液，稱為粘液多糖。胞外多糖，被廣泛認為是青枯雷爾氏菌重要的致病因子[10-11]。因此，研究青枯雷爾氏菌胞外多糖在植物青枯病發生過程中的生理功能對了解青枯病的發生和進行病害的生物防治具有重要的意義。本文從青枯雷爾氏菌胞外多糖合成基因、調控和生理功能等方面進行歸納綜述。

1　青枯雷爾氏菌胞外多糖合成基因

青枯雷爾氏菌是一種革蘭氏陰性細菌，能合成胞外多糖分泌到細胞外適應生存環境。胞外多糖的合成基因形成eps操縱子，由調控基因和合成基因組成，調控基因與合成基因在基因組的位點不相鄰，為合成基因的反式調控因子。目前，在青枯雷爾氏菌中，與胞外多糖合成的結構基因有7個，它們在基因組上成簇存在，如圖1所示。

圖1　青枯雷爾氏菌合成胞外多糖結構基因注：epsA：EPSI多糖外排外膜蛋白；epsP：酪氨酸磷酸酶；epsB：EPSI多糖外排蛋白；epsC：UDP-N-乙酰葡萄糖胺2異構酶；epsD：NDP-N-乙酰-D-半乳糖胺醛酸脫氫酶；epsE：EPSI多糖外排內膜蛋白；epsF：EPSI多糖外排內膜蛋白。

2　青枯雷爾氏菌胞外多糖合成調控

胞外多糖合成主要由全局性調控因子PhcA蛋白調控，PhcA屬于LysR家族蛋白，位于青枯雷爾氏菌毒力因子表達調控網絡的核心，它調節毒力因子如胞外多糖的合成、效應分子的表達、宿主細胞壁降解酶和細胞游動相關蛋白的表達[12]。PhcA通過群體感應系統感知細胞濃度而激活，群體感應系統的誘導物質包括3-羥基棕櫚酸甲酯(3-OH PAME)，在病原菌感染宿主早期，PhcA不表達，當細胞宿主體內達到一定數量時，3-OH PAME積累到一定濃度，激活了PhcA并誘導胞外多糖操縱子表達合成胞外多糖[13]。當細胞濃度達到1×107cfu/mL時，由PhcB合成的群體感應分子3-OH-PAME濃度上升，PhcR通過磷酸化激活PhcA，激活eps操縱子表達合成胞外多糖[14]。圖3為EPS在青枯雷爾氏菌中合成被激活的調控過程，表1為參與EPS合成調控因子。青枯雷爾氏菌的EPS合成的調控研究主要集中在20世紀八九十年代，其中eps操縱子包含12個以上的基因，調控eps操縱子表達的調節基因至少有10個，另外至少有3種以上誘導信號啟動合成胞外多糖[15]。

圖3　青枯雷爾氏菌中EPS合成調控示意圖注：資料來源于文獻[16]。

表1　青枯雷爾氏菌中調控EPS合成的Phc和Eps系統

注：資料來源于文獻[16]。

隨著對EPS合成代謝研究的深入，科學家們發現越來越多的遺傳因子在青枯雷爾氏菌EPS合成調控中發揮作用。目前，在其他微生物中發現越來越多的遺傳因子與EPS合成相關[17-20]，這將為研究青枯雷爾氏菌的EPS代謝調控具有啟發作用。

3　青枯雷爾氏菌胞外多糖的生理功能

胞外多糖被認為是植物病原菌致病發生過程中的一個關鍵的致病因子之一[21]，其積累能力與青枯雷爾氏菌的致病力相關。Denny等[21]通過Tn5插入突變獲得兩類胞外多糖產量不同的青枯雷爾氏菌，第一類菌在豐富培養基上胞外多糖產量低于野生菌株產量的5%，宿主青枯病發病時間延緩，發病植株數為野生菌的1/3；另一類菌在豐富培養基上胞外多糖產量接近野生菌株的產量，其致病力與野生菌沒有顯著差異，表明胞外多糖是青枯雷爾氏菌致病的關鍵毒力因子。在其他植物病原菌中也發現胞外多糖合成能力與致病力相關，通過基因敲除玉米枯萎病菌(Pantoeastewartii)的群體感應系統調控基因lrhA和rcsA，胞外多糖的產量顯著下降，從而降低玉米枯萎病菌的致病力[22]；將胞外多糖降解酶在薔薇科果樹中表達，能降低蘋果和梨樹對火疫歐文氏菌的敏感性[23- 24]。青枯雷爾氏菌侵染宿主后，將宿主的莖制成橫切面切片后，利用胞外多糖抗體對切片染色后在免疫熒光顯微鏡下觀察，可以觀察到青枯雷爾氏菌在導管中形成致密的堵塞[25]；在葡萄病原菌Xylellafastidiosa侵染宿主后顯微鏡中也觀察到堵塞導管的現象[26]。因此，學者認為，青枯雷爾氏菌在宿主導管中定殖后，積累大量的胞外多糖阻塞宿主營養和水分運輸，導致宿主萎蔫[27]。

研究表明，在青枯雷爾氏菌侵染宿主后合成的EPS，能幫助其逃避宿主免疫系統的識別而對自身具有保護作用[28-30]。青枯雷爾氏菌在宿主導管中合成大量的EPS，形成了一個類似的生物膜，可以逃避宿主識別或者提高對宿主分泌殺菌物質的抗性[31]。

病原微生物侵染宿主的能力與其運動能力相關[32]，青枯雷爾氏菌侵染番茄需要其具有運動能力[33]，而胞外多糖與細菌的運動能力相關[34-35]。因此，青枯雷爾氏菌的胞外多糖與其運動能力相關，合成胞外多糖有助于提升其侵染宿主能力。科學家們在研究其他微生物胞外多糖生理功能時，發現其具有吸附營養物質[36]、耐受低溫[37]等功能，但在青枯雷爾氏菌中還未見相關報道。

4　展望

胞外多糖的合成和積累對病原菌的致病力至關重要，闡明其在青枯雷爾氏菌致病過程中的生理功能，有助于研究人員以胞外多糖為靶標，設計新型農藥，為素有植物“癌癥”之稱的青枯病的防治提供一種新的策略。但是近10年來，植物青枯病研究領域的科學家主要關注于病原菌分泌的效應分子在致病性與致病力方面，而忽視了胞外多糖在病害發生進程中的重要性。因此，在研究青枯病防治策略上，可以以胞外多糖為靶標，開發出新型農藥。

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腫瘤是一類細胞周期疾病，經歷多基因、多步驟突變，細胞呈失控性生長，其中細胞凋亡失衡是腫瘤發生、發展的重要機制[6-7]。凋亡抑制蛋白家族是一類抑制凋亡的調節因子，Survivin是上世紀九十年代末發現的凋亡抑制蛋白家族新成員，定位于人類染色體17q25，由142個氨基酸組成，只表達于腫瘤與胚胎組織，與其他凋亡抑制蛋白家族成員比較，Survivin結構簡單，具有其他成員無可比擬的抗凋亡能力。近年來研究顯示，在肺癌、喉癌、胃癌、結直腸癌、鼻咽癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤均可發現Survivin過表達，Survivin已成為腫瘤診斷與治療的新靶點[8-10]。

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