CD117和Sox10在惡性黑色素瘤中的表達及意義

溫莉虹，林瑞潑，陳阿德，黃兆浪，鄭向陽，李秧秧，黃卡特，陳國榮

（1.溫州醫科大學附屬蒼南醫院 病理科，浙江 溫州 325800；2.溫州醫科大學附屬蒼南醫院 科教科，浙江 溫州 325800；3.溫州醫科大學附屬蒼南醫院 檢驗科，浙江 溫州 325800；4.溫州醫科大學附屬第一醫院 病理科，浙江 溫州 325015）

CD117和Sox10在惡性黑色素瘤中的表達及意義

溫莉虹1，林瑞潑2，陳阿德3，黃兆浪1，鄭向陽1，李秧秧4，黃卡特4，陳國榮4

（1.溫州醫科大學附屬蒼南醫院 病理科，浙江 溫州 325800；2.溫州醫科大學附屬蒼南醫院 科教科，浙江 溫州 325800；3.溫州醫科大學附屬蒼南醫院 檢驗科，浙江 溫州 325800；4.溫州醫科大學附屬第一醫院 病理科，浙江 溫州 325015）

目的:分析黏膜、肢端和非肢端皮膚惡性黑色素瘤（MM）中CD117和Sox10表達以及c-kit基因擴增情況，探討其與臨床病理的關系。方法:PCR法檢測黏膜、肢端和非肢端MM中c-kit基因的擴增量，并以色素痣作為對照。免疫組織化學法檢測黏膜、肢端和非肢端MM中CD117的表達量，并與色素痣進行對照。免疫組織化學法檢測黏膜、肢端和非肢端MM中Sox10、S-100和HMB45的表達，比較分析各組陽性細胞數及總的陽性率差異。結果:黏膜、肢端和非肢端MM中c-kit基因擴增量顯著大于色素痣，差異有統計學意義（P＜0.05）。黏膜、肢端、非肢端MM和色素痣中CD117陽性率分別為78.5%、73.6%、73.3%和25.0%，3組MM陽性率均高于色素痣（P＜0.05）。3組MM中Sox10的陽性細胞數均高于S-100和HMB45，差異有統計學意義（P＜0.05）；Sox10、S-100和HMB45在MM中的陽性率分別為100.0%、87.5%和70.8%，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論: c-kit基因擴增及CD117蛋白表達水平增高不僅可作為MM與色素痣的鑒別診斷標志，同時也為MM的靶向治療提供靶點；Sox10陽性率可作為黑色素細胞起源的腫瘤診斷標志。

黑色素瘤；CD117；c-kit；Sox10；免疫組織化學

惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是來源于皮膚和其他器官黑色素細胞的高度惡性腫瘤[1-3]，以起病隱襲、惡性程度高、轉移性強、發展迅速、預后差、病死率高為特點[4-6]。目前缺乏有效的治療方法，且其病理組織學形態多樣，診斷和鑒別診斷存在困難。CD117是一種酪氨酸激酶跨膜受體蛋白[7-8]，在多種類型細胞的信號傳導通路中發揮作用，屬于c-kit原癌基因蛋白產物，有文獻報道稱CD117在MM中表達增高[1]。Sox10基因位于染色體22q13.1，編碼的蛋白含有466個氨基酸殘基，相對分子量約51 kDa，是神經嵴來源細胞的分化標志物，對神經嵴來源的黑色素細胞的分化、成熟和維持起關鍵作用[9-12]。本研究觀察了c-kit基因在MM中的擴增量以及CD117、Sox10蛋白在MM中的表達，探討MM的診斷、鑒別診斷和可能的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 材料 收集蒼南縣人民醫院及溫州醫科大學附屬第一醫院2008-2014年住院或門診診斷為MM的組織標本48例（其中黏膜、肢端和非肢端MM分別為14、19和15例），色素痣12例，均經HE染色及病理證實。

1.2 方法

1.2.1 染色:所有標本均經4%中性甲醛溶液固定。

常規脫水、石蠟包埋，切片厚3 μm，行HE染色、免疫組織化學染色。CD117一抗購于上海長島生物技術有限公司，Sox10、S-100和HMB45一抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司，均為單克隆抗體，以PBS代替一抗作為對照。

1.2.2 免疫組織化學結果判讀:CD117細胞漿/膜棕黃色為陽性表達，Sox10細胞核棕黃色為陽性表達，S-100細胞核/漿棕黃色為陽性表達，HMB45細胞漿棕黃色為陽性表達。各組全部樣本每例隨機選取3個視野計數陽性細胞數，每個視野為195.0 μm× 165.8 μm。

1.2.3 PCR檢測:選取CD117陽性的色素痣和MM標本進行PCR檢測石蠟包埋組織中c-kit 11外顯子基因的表達情況。引物由美國Invitrogen公司合成。引物序列如下:上游:5’-CCAGAGTGCTCTAATGACTG-3’，下游5’-T GACATGGAAAGCCCCTGTT-3’。PCR反應條件為:初始變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃30 s，72 ℃ 45 s，40個循環；72 ℃延伸7 min。反應在ABI StepOne中運行。擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統SYDR/1960下采集圖像并分析。

1.3 統計學處理方法 應用SPSSl7.0統計軟件。計量資料用±s表示，組間差異采用單因素方差分析；計數資料采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD117的表達情況

由圖1可見，色素痣細胞胞漿/膜中只見少量棕色顆粒，而黏膜、肢端和非肢端MM瘤細胞胞漿/膜中可見中等量棕色顆粒，說明MM中的CD117表達量顯著增高。統計分析結果顯示，黏膜、肢端和非肢端MM的陽性細胞數分別為180±5、170±5和170±4，與色素痣（30±2）比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。黏膜、肢端、非肢端MM中CD117陽性率分別為78.5%（11/14）、73.6%（14/19）、73.3%（11/15），高于色素痣的25.0%（3/12），差異有統計學意義（χ2=7.462、7.309、6.328，均P＜0.05）。

圖1 CD117在色素痣和MM中的表達（SP，×100）

2.2 c-kit基因擴增情況

由圖2可見，黏膜、肢端和非肢端MM分別與色素痣比較，其c-kit基因擴增量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3 Sox10表達情況

如圖3所示，Sox10為核染，S-100核/漿染色，HMB45為胞漿染色。黏膜、肢端和非肢端MM中的Sox10分別與S-100、HMB45比較，陽性細胞數差異有統計學意義（P＜0.05），見表1；3組MM中Sox10的陽性率為100%，高于S-100的87.5%和HMB45的70.8%，差異有統計學意義（χ2=6.40、16.39，P＜0.05和P＜0.01）。

圖2 黏膜、肢端、非肢端MM和色素痣組織中c-kit基因擴增情況

3 討論

MM是一種高度惡性腫瘤，約占全部皮膚腫瘤的3%，其死亡病例卻占皮膚腫瘤的65%[13]。近年來，MM全球發病率呈逐年遞增趨勢。目前，對于MM的病理診斷較困難，易誤診。MM細胞形態多變，細胞核多形異染，可見噬伊紅大核仁，核分裂多見，與部分良性痣如Spitz痣的鑒別存在困難，同時也易與某些上皮及間葉組織的非黑色素細胞來源的腫瘤混淆，因此在病理診斷中對于細胞良惡性及細胞來源的鑒別顯得尤為重要。本研究對MM中CD117和Sox10的表達情況進行了探討，為MM的臨床診斷和治療提供依據。

CD117是原癌基因c-kit的蛋白產物，是一種跨膜的酪氨酸酶受體蛋白，可激活酪氨酸激酶信號傳導通路，促進細胞生長、增殖和分化[1，14-15]。本研究通過免疫組織化學法檢測色素痣以及黏膜、肢端、非肢端MM中CD117的表達情況，結果顯示3組MM樣本組織中CD117的表達量及陽性率均高于色素痣，提示CD117可作為鑒別黑色素細胞來源的良惡性腫瘤的標志。CD117表達量取決于c-kit基因的擴增量，本研究PCR檢測結果顯示，c-kit基因的擴增量與CD117的表達量相一致，MM組織中的c-kit基因擴增量顯著大于色素痣，因此，我們推斷，MM的發生可能與c-kit基因表達上調有關，故探討針對c-kit靶點的靶向藥物治療，可能為MM的治療提供一個新的途徑。

圖3 黏膜、肢端、非肢端MM中Sox10、S-100和HMB45免疫組織化學染色結果（SP，×100）

表1 Sox10、S-100和HMB45在MM中的陽性細胞數比較（±s）

表1 Sox10、S-100和HMB45在MM中的陽性細胞數比較（±s）

與S-100比:aP＜0.05；與HMB45比:bP＜0.01

Sox10是一種新近發現的黑色素細胞的標記[12]，在神經嵴演變早期背神經管中表達，然后隨著神經嵴干細胞的分化，表達于其衍生物如周圍神經系統和黑色素細胞中。Sox10與其他轉錄因子協同指導黑色素細胞發育和分化[16]。本研究發現Sox10在MM中的表達量及陽性率均高于S-100和HMB45，因此Sox10是一種比S-100和HMB45更加有效的黑色素細胞來源的腫瘤標志物，可用于黑色素細胞腫瘤與非黑色素細胞腫瘤的鑒別診斷。

綜上所述，本研究結果提示c-kit基因及CD117可作為鑒別黑色素細胞來源的良惡性腫瘤的標志；Sox10可用于黑色素細胞腫瘤與非黑色素細胞腫瘤的鑒別診斷。

[1] 陳文靜. 新疆地區惡性黑素瘤c-kit基因突變及CD117表達分析[D]. 烏魯木齊: 新疆醫科大學, 2013.

[2] 倪淑娟, 陳曉晨, 王奇峰, 等. 肛管直腸惡性黑色素瘤c-kit基因突變研究[C]//中華醫學會病理學分會2010年學術年會, 2010.

[3] 胡孟鈞, 魏建麗. 粘膜原發性惡性黑色素瘤10例病理分析[J]. 溫州醫學院學報, 1999, 29(3): 253.

[4] CSCO黑色素瘤專家委員會. 中國黑色素瘤診治指南(2011版)[J]. 臨床腫瘤學雜志, 2012, 17(2): 159-171.

[5] GARBE C, PERIS K, HAUSCHILD A, et al. Diagnosis and treatment of melanoma. European consensus-based interdisciplinary guideline-Update 2016[J]. Eur J Cancer, 2016, 63: 201-217.

[6] 李騰政, 羅文, 張吉翔. SOX10在黑色素瘤中的作用[J]. 實用醫學雜志, 2015, 1(19): 3267-3268.

[7] WEHRLE-HALLER B. The role of Kit-ligand in melanocyte development and epidermal homeostasis[J]. Pigment Cell Res, 2003, 16(3): 287-296.

[8] GIEHL K A, NAGELE U, VOLKENANDT M, et al. Protein expression of melanocyte growth factors (bFGF, SCF) and their receptors (FGFR-1, c-kit) in nevi and melanoma[J]. J Cutan Pathol, 2007, 34(1): 7-14.

[9] CRONIN J C, WATKINS-CHOW D E, INCAO A, et al. SOX10 ablation arrests cell cycle, induces senescence, and suppresses melanomagenesis[J]. Cancer Res, 2013, 73(18): 5709-5718.

[10] AOKI Y, SAINT-GERMAIN N, GYDA M, et al. Sox10 regulates the development of neural crest-derived melanocytes in Xenopus [J]. Dev Biol, 2003, 259(1): 19-33.

[11] LIU H G, KONG M X, YAO Q, et al. Expression of Sox10 and c-kit in sinonasal mucosal melanomas arising in the Chinese population[J]. Head Neck Pathol, 2012, 6(4): 401-408.

[12] NONAKA D, CHIRIBOGA L, RUBIN B P. Sox10: a panschwannian and melanocytic marker[J]. Am J Surg Pathol, 2008, 32(9): 1291-1298.

[13] DZWIERZYNSKI W W. Managing malignant melanoma[J]. Plast Reconstr Surg, 2013, 132(3): 446-460.

[14] SATZGER I, SCHAEFER T, KUETTLER U, et al. Analysis of c-kit expression and KIT gene mutation in human mucosal melanomas[J]. Br J Cancer, 2008, 99(12): 2065-2069.

[15] POSCH C, MOSLEHI H, SANLORENZO M, et al. Pharmacological inhibitors of c-kit block mutant c-kit mediated migration of melanocytes and melanoma cells in vitro and in vivo[J]. Oncotarget, 2016, 7(29): 45916-45925.

[16] KELSCH R N. Sorting out SOX10 functions in neural crest development[J]. Bio Essays, 2006, 28(8): 788-798.

（本文編輯：丁敏嬌）

Expression and signif cance of CD117 and Sox10 in malignant melanoma

Objective:To analyze the value of CD117, Sox10 expression and c-kit gene amplif cation in mucous, acral and non-acral melanoma and explore the relationship between it and clinical pathology.Methods:The gene levels of c-kit in mucosal, acral and non acral melanoma were detected by PCR, with pigmented nevus as control. The protein expressions of CD117, sox10, 1-100 and HMB45 were detected by immunohistochemistry.Results:The expression of c-kit gene from the three MM groups was higher than that of pigmented nevus (P＜0.05). The immunohistochemical results demonstrated that the number of positive cells of CD117 from the three MM groups was marginally higher than that of pigmented nevus (P＜0.05). The number of positive cells of Sox10 in the three MM groups was higher than that of S-100 and HMB45 (P＜0.05). The positive rate of CD117 in mucosal, acral and non acral MM was 78.5%, 73.6% and 73.3% respectively, while 25% in pigmented nevus control (P＜0.05). The positive rate of Sox10, S-100 and HMB45 in MM was 100.0%, 87.5% and 70.8% respectively (P＜0.05).Conclusion:C-kit gene amplif cation and its downstream transcription protein CD117 enhanced positive expression can be applied as clinical potential therapy target. The positive rate of Sox10 is higher than S-100 and HMB45, and may be applied as tumor differentiation marker for origins of melanocytes.

melanoma; CD117; c-kit; Sox10; immunohistochemistry

R365

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.009

2016-09-18

蒼南縣科技計劃項目（2015S05）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20130001）；浙江省科技廳國際合作項目（2013C24031）。

溫莉虹（1980-），女，浙江蒼南人，副主任醫師。

陳國榮，教授，主任醫師，碩士生導師，Email:chengr1978@aliyun.com。

WEN Lihong1, LIN Ruipo2, CHEN Ade3, HUANG Zhaolang1, ZHENG Xiangyang1, LI Yangyang4, HUANG Kate4, CHEN Guorong4.

1.Department of Pathology, the Aff liated Cangnan Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800; 2.Department of Science and Education, the Aff liated Cangnan Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800; 3.Department of Clinical Laboratory, the Aff liated Cangnan Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800; 4.Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015