紅掌高效再生體系及遺傳轉化體系的建立

（黑龍江省哈爾濱市農業科學院生物中心，150029）

摘 要 以紅掌葉片為外植體，通過愈傷組織誘導、叢生芽分化及壯苗和生根培養，成功建立紅掌高效再生體系。試驗結果表明：當6-BA的濃度為1.5 mg/L，2，4-D的濃度為0.2 mg/L時，有愈傷組織產生的葉片數最多，愈傷組織狀態也最好；分化培養基為“MS+BA 1.0+KT 0.5， Agar0.8%，Suc30%”； 卡那霉素最終篩選濃度為2.0 mg/L；除菌劑為100 mg/L阿莫西林克拉維酸鉀或500 mg/L頭孢唑啉鈉。討論了外植體切割方法。

關鍵詞 紅掌；再生體系；遺傳轉化體系；分化培養基；除菌劑；外植體切割方法

中圖分類號：S682；Q813.1 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.7.021

知網出版網址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20170320.2320.018.html 網絡出版時間：2017-3-20 23：20：00

紅掌（Anthurium andraeantm Lind）又名安祖花、火鶴花等，屬天南星科花燭屬[1]，是世界上非常流行的切花和盆花[2]。原產于南美洲的熱帶雨林地區 ，現歐洲、亞洲、非洲皆有廣泛栽培。因其花色鮮艷，色彩豐富，備受人們喜愛。紅掌的育種主要采用雜交育種技術[3]。繁殖方式以分株扦插為主，成本高，繁殖率低。紅掌制種需要人工授粉，費時費力，且受自然因素影響較大。紅掌組織培養起始于1974年，由Pierik完成[4]。組織培養是解決紅掌扦插效率低最有效的方法，通過添加合適的外源調節劑就可以起到良好的擴繁效果。本研究將組織培養與基因工程有效結合在一起，通過對除菌劑和抗生素的篩選，成功建立起高效的遺傳轉化體系。期望通過轉基因手段可以更加豐富紅掌的種類，提高紅掌的品質。

1材料與方法

1.1紅掌高效再生體系的建立

1.1.1試驗材料

盆栽紅掌品種由哈爾濱市農業科學院生物中心組培室提供。

1.1.2試驗方法

選取紅掌健康葉片，去掉葉脈，將葉片在70%酒精中浸泡30 s，轉移至0.1% HgCl2中滅菌5 min，無菌水沖洗3～5次，接種在愈傷組織誘導培養基上。待葉片分化出黃綠色的愈傷組織后，將其接種在分化培養基上進行分化培養，15 d繼代1次。將分化出的叢生芽接種到BA減半的培養基上進行壯苗培養。待再生植株在生根培養基上分化出3～4條根便可進行馴化、移栽。每個處理30瓶，每瓶接種5片。

1.2紅掌遺傳轉化體系的建立

1.2.1試驗材料

植物材料：紅掌葉片誘導出的愈傷組織。

菌株：根癌農桿菌LBA4404。

試劑：鏈霉素Sm （50 mg/L）、利福平Rif （50 mg/L）、卡那霉素Km （100 mg/L）、阿莫西林克拉維酸鉀2∶1（100 mg/L）、頭孢唑啉鈉（500 mg/L）。

1.2.2試驗方法

在分化培養基中添加不同濃度的卡那霉素，濃度初定為：0， 50， 75， 100和150 mg/L。15 d繼代1次，30 d后統計結果。

將愈傷組織在分化培養基上培養3 d。而后放于無菌三角瓶內，加入適量重懸好的菌液，侵染15 min。28℃暗培養條件下共培養3～4 d，以肉眼可見菌落為準。

2結果與分析

2.1紅掌高效再生體系的建立

愈傷組織誘導基本培養基為MS，添加不同濃度的6-BA和2，4-D。試驗結果表明，當6-BA的濃度為1.5 mg/L，2，4-D的濃度為0.2 mg/L時，有愈傷組織產生的葉片數最多，愈傷組織狀態也最好；當6-BA濃度增加時，愈傷組織有白色根狀物質產生；當2，4-D濃度增加時，愈傷組織出現硬實和褐化狀態。

將誘導出的狀態佳的愈傷組織轉接到分化培養基上，進行分化培養。分化基本培養基同樣選擇MS。從結果可以看出，當培養基中只添加BA時，無論濃度多少，均未有叢生芽分化；當培養基中添加BA和NAA時，有少量叢生芽產生，但狀態較差，并有徒長現象（見圖1）；當BA的濃度為1.0 mg/L，KT的濃度為0.5 mg/L時，叢生芽的分化數量最多，且長勢最好（見圖2）。故確定分化培養基為“MS+BA 1.0+KT 0.5， Agar0.8%，Suc30%”。

待叢生芽長至2～4 cm時，將其從基部切下接種在BA減半的培養基上進行壯苗培養。此時，壯苗培養基中可添加0.5 mg/L NAA，誘導再生苗生根。也可在再生植株長至5 cm高時轉接到生根培養基中進行生根培養（見圖3）。

2.2紅掌遺傳轉化體系的建立

經過3次不同梯度的卡那霉素篩選試驗，發現當卡那霉素濃度為0.5 mg/L時，部分叢生芽出現萎蔫或停止生長狀態，存活率只有46.7%；當卡那霉素濃度為1.0 mg/L時，只有個別叢生芽繼續生長，存活率下降為20%；當卡那霉素濃度為2.0 mg/L時，叢生芽出現大面積死亡。確定卡那霉素最終篩選濃度為2.0 mg/L（見圖4）。

除菌劑篩選試驗采用除菌劑不同種類和不同濃度進行。試驗發現，用100 mg/L阿莫西林克拉維酸鉀作為除菌劑，外植體的分化率為53.3%，愈傷組織狀態良好；用50 mg/L阿莫西林克拉維酸鉀作為除菌劑，外植體的分化率為60.0%，愈傷組織狀態良好，但有少量外植體出現重復污染現象；用500 mg/L頭孢唑啉鈉作為除菌劑，外植體的分化率為50.0%，愈傷組織狀態良好；用250 mg/L頭孢唑啉鈉作為除菌劑，外植體的分化率為60.0%，愈傷組織狀態良好，有少量重復污染。確定最終除菌劑為100 mg/L阿莫西林克拉維酸鉀或500 mg/L頭孢唑啉鈉。

3討論

蘭芹英等認為，采用同一成熟度的紅掌外植體，葉柄的誘導效率和誘導時間均優于葉片[5]。在本試驗中發現，利用紅掌葉片誘導愈傷組織時，切割方式也對誘導率有一定影響。本研究發現，采用打孔法時，葉片周圍會有增厚趨勢，隨著時間延長，有少量愈傷組織產生，但并無叢生芽分化現象。將葉片剪成1 cm2的方塊，葉片出現皺縮、褐化，并無叢生芽產生。將葉片橫向切3～4刀，正面朝上，直接接種在培養基上，可誘導出較好愈傷組織。郭維明等和趙云鵬等認為，紅掌離體誘導存在多種途徑，主要取決于培養條件和外植體的基因型[6-8]。郭軍戰等利用葉柄作為外植體同樣誘導出大量愈傷組織[9]。呂復兵等利用帶主脈的幼嫩葉片同樣獲得較高誘導率[10]。夏時云和朱青松認為，紅掌葉片在進行脫分化時，GA3的含量隨著時間而降低[11-12]。

參考文獻：

[1]張永紅，王蓮英.安祖花生長發育特性實探[J].北京林業大學學報，1995，17（2）：73-79.

[2]姜蕾，易懋升，蘭天維，等.紅掌種子萌發特性的研究[J].種子，2006，25（1）：19-22.

[3]張志勝，黎揚輝，姜蕾，等.紅掌四倍體的離體誘導及其鑒定[J].園藝學報，2007，34（3）：729-734.

[4]Pierik R L M， Steegmans H H M. Plantlet formation in callus tissues Anthurium andraeantm Lind[J]. Scientia Horticulturae， 1974， 2： 193-198.

[5]蘭芹英，李啟任，何惠英，等.紅掌愈傷組織誘導及芽的分化[J].園藝學報，2003，30（1）：107-109.

[6]郭維明，趙云鵬，文方德.花燭愈傷組織不同繼代培養的再分化差異[J].園藝學報，2004，31（1）：69-72.

[7]趙云鵬，郭維明，王廣東.花燭不同愈傷組織解剖結構的觀察[J].園藝學報，2005，32（1）：60-64.

[8]陳超，王桂蘭，邸智勇.紅掌愈傷組織和再生團塊發育過程中糖和蛋白質的組織化學研究.園藝學報，2008，35（10）：1484-1490.

[9]郭軍戰，費昭雪，成密紅.紅掌不同外植體愈傷組織誘導與不定芽分化的研究[J].西北林學院學報，2006，21（3）：72-74.

[10]呂復兵，王碧清.紅掌葉片離體培養與植株再生研究[J].廣西農業科學，2002，6（2）：24-25.

[11]夏時云，麥瑜玲，許繼勇，等.紅掌葉片離體培養過程中內源激素含量的變化[J].華北農學報，2006，21（3）：16-18.

[12]朱青松，梅康鳳，王沙生.外源生長素對煙草愈傷組織分化和內源IAA含量的影響[J].北京林業大學學報，1999，21（1）：22-25.

（責任編輯：丁志祥）