魚肉制品中N-亞硝胺類化合物檢測研究進展

魏延玲，劉洪巖，趙彥華*

（1.沂水縣市場監督管理局，山東 臨沂276000；2.江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京210017）

N-亞硝胺（N-nitrosamines,NAMS），是一類含有N-N=O官能團化合物的總稱，一般結構可表示為R2（R1）=N-N=O。連接在氨氮上的R1、R2官能團可以為單個氫原子到復雜的化學取代基[1]，當R1或R2為酰基時，稱為亞硝酰胺，當R1、R2為烷基時，稱為亞硝胺。能夠被水蒸氣直接蒸餾出來而被測定的N-亞硝胺稱為揮發性N-亞硝胺，否則為非揮發性N-亞硝胺[2]。

N-亞硝胺廣泛存在于腌制、風干、烘烤等蛋白質含量豐富的肉類加工食品中。醫學研究證明，已知的300多種N-亞硝胺，約90%以上具有毒性、致癌性，并且該毒性可通過母嬰血胎屏障傳遞給胎兒。1978年國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer）將N-亞硝胺類化合物定義為有強致癌性的食源性污染源。N-亞硝胺類化合物的致癌性具有明顯的親器官性，N-亞硝基二甲胺（NDMA）易造成動物肝臟及腎臟的癌變，N-亞硝基二乙胺（NDEA）易造成動物鼻腔及肝臟的癌變[2]。鑒于N-亞硝胺類化合物的毒性及致癌性，許多國家均對食品中N-亞硝胺的限量做出了要求：美國農業部規定腌肉制品中揮發性N-亞硝胺類化合物總量不得超過10μg/kg[3]，俄羅斯國家的規定中要求生食品和煙熏食品中N-亞硝胺不得超過2和4μg/kg[4]，我國國家標準中規定肉類及肉制品和水產品中NDMA分別不得超過3和4μg/kg[5]。

1 N-亞硝胺的分類

N-亞硝胺種類繁多，其致癌性隨著烴鏈的延長而逐漸降低。食品中常見的N-亞硝胺類化合物見表1。

表1 常見的N-亞硝胺類化合物

續表

2 魚肉制品中N-亞硝胺的前處理技術

魚肉制品組成基質十分復雜，且N-亞硝胺類化合物含量低。因此，無論何種檢測方法，樣品前處理技術都仍然是N-亞硝胺檢測的難點和關鍵點。目前魚肉制品中常用的N-亞硝胺前處理技術主要有：水蒸氣蒸餾法[6-9]、固相萃取法[10]、固相微萃 取法[11-12]、超聲波提取法[13-14]、液液萃取法[15-16]、QuEChERS法[17-21]等。

2.1 水蒸氣蒸餾法

水蒸氣蒸餾法是通過將樣品與水一起蒸餾，待測的揮發性N-亞硝胺類化合物被蒸餾出后經冷凝收集的前處理方法。該方法是魚肉制品中揮發性N-亞硝胺提取的傳統方法，不僅能有效去除魚肉制品中大部分非揮發性雜質，還能實現樣品高倍數濃縮。但該法的缺點是樣品用量大，有機溶劑消耗量大，前處理步驟繁瑣，蒸餾時間長。另外，如果魚肉制品中脂肪含量高，使用該法會有大量脂肪同時被提出，為后期的凈化造成不便，且回收率不穩定，不適用于高通量分析。

2.2 固相萃取法

固相萃?。⊿PE）技術最早開始于20世紀70年代，是一項集樣品分離、富集、凈化、溶劑轉換于一體的技術。該技術能有效地將待測物質與干擾物質分離，與傳統的液液萃取法相比，操作簡單，待測成分回收率高。固相萃取法對環境污染小，方法簡便，可操作性強，對樣品選擇性吸附效果好，是目前萃取、分離N-亞硝胺類化合物最廣泛的應用方法。

2.3 固相微萃取法

固相微萃取技術（solid-phase microextraction,SPME）是20世紀90年代開始得到應用的一項新技術[22-23]。該技術利用相似相溶的原理，通過石英纖維表面實現對復雜基質中待測有機成分的吸附、富集，再通過進樣時的高溫，使待測組分從吸附劑中解吸而進行測定。該技術實現了從取樣到進樣全自動化的操作，方法簡單，操作快捷。固相微萃取方法檢測范圍廣、污染小、檢測快速方便、檢出限高。但也有一定的缺陷，如試驗中容易存在萃取不完全、解吸不完全、目標物殘留等問題，易造成檢測結果重復性差。同時，固相微萃取過程中，纖維萃取頭的選取至關重要，而纖維萃取頭的價格昂貴，使用次數有限。因此，目前該方法不適用于高通量檢測[24-26]。

2.4 超聲波提取法

超聲波傳播時形成的機械效應、熱效應和空化效應，能迫使樣品基質空間距離拉大，實現待測物質與提取溶劑之間更完全的接觸，從而加快了待測物質從目標基質進入萃取溶劑中的速度[27-28]。肉制品基質復雜，采用超聲波提取時，會有大量干擾物質一并提取出來，多半結合固相萃取進行純化，才能得到理想的萃取效果。超聲波萃取為常壓萃取，安全性高，操作簡單易行，設備維護保養方便。目前該項技術在中藥制劑提取方面應用較廣泛。

2.5 液液萃取法

液液萃取是指通過目標物在兩種液相中溶解度差異將目標物從一種液相轉移到另一種液相中的過程。N-亞硝胺類化合物在堿性或中性溶液中溶解度一般較小，而在二氯甲烷、乙腈、醇類等有機溶劑中溶解度相對較大，故而可利用有機溶劑來萃取N-亞硝胺類化合物。該方法成本低，操作快捷、但是操作過程中待測物質損耗量大。

2.6 QuEChERS法

QuEChERS法，即快速基質分散凈化法，是近年來發展起來的一種快速樣品前處理方法。該方法主要側重于樣品的除雜及凈化，利用的是吸附劑對樣品基質中物質的吸附過程。QuEChERS法前處理過程簡單，耗時短，溶劑消耗量少，成本低，適用于高通量檢測，是目前發展速度較快的前處理方法。

3 常用的N-亞硝胺檢測方法

目前，魚肉中用于N-亞硝胺的檢測方法主要有氣相色譜-質譜法、氣相色譜-串聯質譜法、氣相色譜-氮磷檢測法、氣相色譜-熱能分析儀法、高效液相色譜-串聯質譜法等。

3.1 氣相色譜-質譜法

氣象色譜-質譜聯用法（GC-MS）是結合氣相色譜的分離能力和質譜確定分子質量和分子結構的能力，實現對多組分復雜混合物未知組分的定性和定量分析，可同時完成目標物的分離和鑒定。該方法多用于復雜基質中易揮發且熱穩定強的目標物的分析[29]。氣相色譜-質譜聯用法的靈敏度高，定性準確，但對于不易氣化、熱穩定性差的N-亞硝胺類化合物較難檢測[30]。

3.2 氣相色譜-串聯質譜法

采用質譜分析時，普遍存在基質效應的問題，基質效應可減弱或增強目標物的信號，從而影響檢測的靈敏度和準確性。氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS），抗干擾能力較單質譜強，對于低分子質量的化合物靈敏度相對較高，選擇性相對較強，更適合復雜食品基質中N-亞硝胺類化合物的分析檢測[3]。翟孟婷等[31]通過氫氧化鋇堿溶液對樣品進行皂化除雜，上清液經二氯甲烷萃取，提取液濃縮經GC-MS/MS分析檢測。試驗選取極性的DBWAXUI為色譜柱，確定目標物保留時間、母離子及兩個二級離子響應比值，采用內標物制作校正曲線，用內標法進行定量，得出的方法定量限為0.25～0.76μg/kg，加標回收率為71.6%～133.8%。該方法能夠滿足水產品和加工肉制品中N-亞硝胺的檢測需求。

3.3 氣相色譜-氮磷檢測法

氮磷檢測器（NPD）是一種適用于含磷、氮物質檢測的專屬性電離型檢測器，對含有磷、氮元素物質的檢測具有相對較高的靈敏度[32]。N-亞硝胺類化合物中均含有氮元素，氮磷檢測器對其有特異的響應值，因而適用于揮發性N-亞硝胺的痕量分析[30]，但氮磷檢測器價格昂貴且專用性強，一般實驗室很難配備。

3.4 氣相色譜-熱能分析儀法

熱能分析儀（TEA）是一款專門用于檢測N-亞硝基化合物的檢測器，其工作過程為TEA裂解室利用高溫將經過色譜分離后進入裂解室的目標物中的N-NO鍵斷裂，斷裂后的亞硝基被臭氧氧化，形成能夠衰變并發出特征光波的電子激發態二氧化氮，繼而可根據輻射強度判斷N-亞硝胺含量[33]。馬興等[8]改進了國標方法，通過快速水蒸氣蒸餾，采用N-亞硝基二異丙胺作為內標，結合氣相色譜熱能分析儀，熱能分析儀接口溫度250℃，熱解室溫度500℃，所得方法檢出限能滿足肉制品和水產品的國家限量要求。相比于應用更為廣泛的GC-MS，GC-TEA的靈敏度更高，尤其是在針對存在相似物質干擾時，GC-TEA的穩定性和重復性更好，但TEA只針對亞硝基化合物的檢測，且其價格較為昂貴，應用面窄，一般實驗室很難配備。

3.5 高效液相色譜-串聯質譜法

高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS），將樣品溶液注入HPLC色譜柱中，待測物質在流動相的作用下，利用待測物質與固定相不同的相互作用來分離待測物質，然后再將洗脫后的待測組分引入質譜儀中進行定性和定量的檢測。該方法檢測范圍較廣，不僅適用于小分子質量、揮發性N-亞硝胺的檢測，對于非揮發性或熱不穩定的N-亞硝胺類化合物也具有較高的分析能力。

3.6 其他方法

N-亞硝胺的檢測方法還有氣相色譜-氫火焰檢測器法、膠束電動色譜法、電化學法、紫外-可見分光光度法等。由于這些方法均存在一定局限性，靈敏度低、缺乏特異性、準確度較低、重復性差，已經逐漸被其他檢測儀器所取代。

4 討論與展望

N-亞硝胺類化合物廣泛存在于各類食品及環境中，且對生物具有較強的毒性及致癌性，近年來對N-亞硝胺類化合物的研究已經成為食品安全領域中的一個重要研究課題。N-亞硝胺主要由亞硝酰離子與胺類物質反應產生，但是環境中的N-亞硝胺含量很低，人體內的N-亞硝胺主要來源于加工食品中存在的N-亞硝胺及日常攝入體內的亞硝酸鹽在人體內的合成[34-35]。亞硝酸鹽是最常見的亞硝化劑，廣泛應用于肉制品的生產加工中，它能有效抑制肉制品中肉毒桿菌的生長，并且具有改善肉制品風味和色澤、保水等方面的性能。

食品，尤其是魚肉制品基質較為復雜，前處理難度較大，雖然已經有QuEChERS法、分散液液微萃取法、固相微萃取法等改進的快速前處理方法，但其前處理時間、凈化效果等仍然存在很大的優化空間。目前，對N-亞硝胺的檢測多依賴于大型儀器，而對N-亞硝胺快速檢測研究卻較少。研究食品中N-亞硝胺的抑制、消除及快速檢測將是未來N-亞硝胺研究的一個重要方向。