葉綠體生物制藥的研究進展

程明林

(青島科技大學 化工學院，山東 青島 266000)

生物制藥在治療人類疾病方面起著重要的作用。然而，它們生產成本高，需要高純度和低溫儲存，同時又受到短時間保質期的限制。通過開發具有低成本效益的大規模生產重組蛋白的表達平臺可以解決這些問題[1]。轉基因植物生產的藥用蛋白質在很大程度上被生物技術工業所拋棄，主要是由于其產量低和最終產品的結構異質性所導致[2]。相比之下，轉基因表達具有將轉基因精確整合到葉綠體基因組內位點的能力，具有更高的產量和更穩定的基因表達水平等優點，在可食用植物細胞的葉綠體中生產治療蛋白質取得了顯著進展[3]。

1 葉綠體中的轉錄修飾(PTM)機制

PTM在維持治療性蛋白質的穩定性和生物活性方面起著重要作用[4]。雖然植物細胞質和分泌途徑中的PTM途徑已被大量闡明，但是葉綠體中蛋白質修飾的機制仍然知之甚少。可逆磷酸化幾乎在細胞過程的每個環節都嚴格調節蛋白質功能的活性。因此，異常磷酸化是許多疾病的主要原因之一，包括癌癥、神經變性和慢性炎癥[5]。研究表明，凝血因子磷酸化會增強激活蛋白C(APC)失活的敏感性，從而降低凝血效率[6]。同樣，組織因子的高磷酸化阻止了它與其他止血蛋白的相互作用，并干擾凝血酶的形成[7]。通過定位葉綠體的磷酸蛋白和執行磷酸化功能的激酶來證明植物葉綠體中磷酸化活性的存在。植物葉綠體中復雜的氧化還原調節機制表明葉綠體系統中多聚體蛋白的組裝與二硫鍵的形成有關[8]。二硫鍵的形成對穩定三級結構和促進多種重組治療蛋白的功能起著重要的作用。在植物葉綠體中生產藥物蛋白質以治療糖尿病和傳染病等疾病，表明了葉綠體中存在著內源性蛋白二硫轉移酶，以確保適蛋白質的完整。在葉綠體中表達的RC101(逆轉錄酶)被認為是二硫鍵的環化。此外，葉綠體衍生的CTB融合蛋白與GM1受體的有效結合需要通過二硫鍵形成五聚體結構。除了內源性酶外，外源蛋白二硫鍵異構酶和硫氧還蛋白的共同表達使人血清蛋白在葉綠體中蛋白質折疊效率提高[9]。

2 植物葉綠體中重組蛋白的功能

2.1 預防和治療傳染病

將各種從細菌，病毒，真菌或原生動物的疫苗抗原克隆到葉綠體表達載體中，并通過基因槍轟擊將其轉化成葉綠體基因組[3]。一旦實現了同源，重組蛋白的高水平表達占總蛋白的70%[10]。已經在植物葉綠體中表達了幾種亞單位疫苗候選物，針對各種感染性病原體[7]。針對全球傳染病產生的PMB包括幾種結核分枝桿菌疫苗抗原，炭疽芽孢桿菌保護性抗原(PA)和脊髓灰質炎(脊髓灰質炎VP1)疫苗抗原，表達水平占全部可溶性蛋白質的4%至18%。除亞單位疫苗抗原外，抗原肽(AMP)也已在葉綠體中表達[11]。AMPs是在一類不斷增長的低分子量寡肽，廣泛的抗菌活性，對病毒、真菌和細菌有廣泛的抗菌作用。與抗生素不同，AMPs針對微生物細胞膜中的脂多糖，并誘導快速殺死病原體。除抗菌作用外，AMPs已被證明具有免疫調節和傷口愈合的特性[12]。

2.2 治療代謝紊亂

在糖尿病治療中蛋白質治療有著最高的需求。利用轉基因技術在植物質粒中完成胰島素的表達水平占總可溶性蛋白的50%。轉基因植物的大規模生產使植物胰島素劑量每年增加2000萬。在植物葉綠體中，葉綠體表達的CTB-胰島素原融合蛋白有效組裝可在動物模型中具有完全功能。利用胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)刺激胰腺分泌胰島素來治療II型糖尿病。由于GLP-1在血清中的半衰期非常短，治療II型糖尿病集中在二肽基肽酶IV(DPP-IV)類似物(如：毒蜥外泌肽-4(EX4))，其具較長的血清半衰期(≥4h)。小鼠口服給藥植物衍生的EX4融合人轉運蛋白(轉鐵蛋白)，通過刺激胰島素的分泌來降低葡萄糖，并促進胰腺b細胞的分化和增殖[13]。此外，葉綠體表達的CTB-EX4在口服給藥時表現出刺激胰島素的作用，而不引起低血糖的副作用[14]。CTB-EX4融合蛋白在轉基因植物中有非常高的產量并且成本效益低，使其成為治療II型糖尿病最理想的口服生物藥物。

2.3 免疫調節

血友病是由凝血因子X連鎖突變引起的一種出血性疾病。目前，終身輸注凝血因子VIII(FVIII，治療血友病A)或因子IX(FIX，治療血友病B)是血友病患者的治療標準。血友病治療的主要問題是連續輸入蛋白質后會抑制抗體的發展。這種對蛋白質抗原的免疫引起的過敏反應，在嚴重的情況下是致命的[15]。目前免疫耐受誘導(ITI)的臨床方案需要長期施用高劑量的凝血因子。然而，這種臨床方案非常昂貴，并不能保證有效的免疫耐受。在蛋白質替代治療期間，通過口服給藥植物細胞表達的FIX可誘導免疫耐受性[16]。通過口服給藥在葉綠體中表達全長FIX結構域或凍干轉基因植物細胞凝血因子VIII可成功地消除了小鼠體內抑制劑的形成[17]。除血友病外，口服給藥在植物葉綠體中表達的酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)抗原決定簇可讓小鼠消除了龐貝氏癥的抗體反應[18]。因此，使用在葉綠體中表達抗原的免疫調節是可行的。

3 結語

在植物葉綠體中生產功能性藥物蛋白質通過口服給藥用以治療糖尿病、血液疾病、代謝紊亂和傳染病以及免疫調節是可行的，并且解決了生物制藥生產成本高昂和難儲存的問題。然而功能性蛋白質的開發仍面臨挑戰。例如，來源細菌的原核基因的高水平表達是可行的，但大型基因(人類或病毒)的表達仍未解決。因此，必須在可食用作物中開發無標記的轉基因植物，以推進葉綠體生物藥物臨床應用。更重要的是，需要進一步的研究來了解在植物葉綠體中表達的外源蛋白質的翻譯后修飾。這應有助于進一步推進在植物細胞中制備口服給藥的生物藥物。

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