谷胱甘肽高產(chǎn)酵母融合子的制備及發(fā)酵工藝

錢衛(wèi)東, 吳啟航, 劉昱辰, 王 婷, 毛培宏

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.西北大學 生命科學學院， 陜西 西安 710069； 3.新疆大學 物理科學學院， 新疆 烏魯木齊 830046)

谷胱甘肽高產(chǎn)酵母融合子的制備及發(fā)酵工藝

錢衛(wèi)東1, 吳啟航1, 劉昱辰1, 王 婷2, 毛培宏3

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.西北大學 生命科學學院， 陜西 西安 710069； 3.新疆大學 物理科學學院， 新疆 烏魯木齊 830046)

為構建谷胱甘肽(glutathione，GSH)高產(chǎn)酵母菌株，本實驗利用原生質(zhì)體融合方法制備多形漢遜酵母和粟酒裂殖酵母融合子，結合自主設計的耐高溫、鉬酸鈉和乙醇耐受性培養(yǎng)基方法高通量篩選酵母融合子，進而利用DTNB法定量測定GSH高產(chǎn)酵母融合子，并分析GSH高產(chǎn)酵母融合子的遺傳穩(wěn)定性，最后對其發(fā)酵工藝進行研究.結果表明，本實驗利用原生質(zhì)融合方法成功構建一株GSH產(chǎn)量高、遺傳穩(wěn)定的GSH高產(chǎn)酵母融合子，為低成本、高效生產(chǎn)GSH提供了新途徑.

多形漢遜酵母菌； 粟酒裂殖酵母菌； 原生質(zhì)體融合； 融合子

0 引言

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的活性三肽，幾乎存在于生物體的所有細胞中，由于半胱氨酸上所具有的活性基團巰基可與重金屬、碘乙酸等毒素相結合，使其具有整合解毒作用，即GSH具有廣譜解毒作用[1]；此外，GSH還具有抗氧化作用，達到延緩機體衰老的功效.因此，GSH在醫(yī)藥、保健食品和化妝品等行業(yè)有著廣泛的應用[2].

目前，國內(nèi)GSH的市場需求量日益增多，但我國GSH幾乎完全依賴進口.GSH的生產(chǎn)方法有化學合成法、萃取法、酶法和發(fā)酵法[3].其中，發(fā)酵生產(chǎn)GSH法因其產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、易分離、無污染等優(yōu)點，日益?zhèn)涫車鴥?nèi)外學者關注.目前，國外在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)GSH的研究水平較高，而國內(nèi)發(fā)酵生產(chǎn)GSH的整體水平與國外相比仍有差距，這歸因于缺乏高質(zhì)量的菌株發(fā)酵生產(chǎn)菌株，因此開發(fā)性能優(yōu)良的GSH高產(chǎn)菌株意義明顯.目前，用于發(fā)酵GSH最常用的菌株主要為酵母菌，其中GSH含量較高的為多形漢遜酵母屬、裂殖酵母屬、釀酒酵母屬和假絲酵母屬[4-6].

作為食品級的多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)DL-1因其具有安全性高、培養(yǎng)成本低、耐高溫、生長速度快及易高密度發(fā)酵等優(yōu)點，近年來備受關注.加上遺傳背景清晰、遺傳操作簡單的粟酒裂殖酵母也具備優(yōu)良的GSH生產(chǎn)能力.因此，如何充分整合兩株酵母GSH生產(chǎn)性能，進而結合兩者清晰的遺傳操作背景開展定向分子改良，將為高效生產(chǎn)GSH提供新思路.為此，本實驗以多形漢遜酵母菌株DL-1和粟酒裂殖酵母為出發(fā)菌株，利用細胞融合技術整合兩種酵母優(yōu)良性能，并結合自主設計的高通量篩選方法，構建GSH高產(chǎn)酵母融合子[7,8].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha，H.polymorpha)DL-1，源于中國工業(yè)微生物保藏中心，保藏號為ATCC No.26012；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe，S.promb)(S.promb2.1794)，購自中國科學院微生物研究所.

1.1.2 試劑及儀器

(1)主要試劑： 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和GSH標準品，來源于Sigma公司；其余試劑均來源于天津市天力化學試劑有限公司；

(2)主要儀器：高速冷凍離心機(sigma)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海普度實驗設備有限公司)、超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設備公司)、高壓蒸汽滅菌鍋(上海賽默生物科技發(fā)展有限公司)、紫外可見分光光度計(上海光譜儀器廠).

1.2 方法

1.2.1 酵母融合子的制備

(1)原生質(zhì)體的制備

分別取多形漢遜酵母和粟酒裂殖酵母種子液200μL，轉接于10 mLYPD培養(yǎng)基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，pH7.2)中，37 ℃和28 ℃，140 r/min，培養(yǎng)16～18 h.取新鮮發(fā)酵液1 mL，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，再加入1 mL預處理液(0.05 mol/L EDTA水溶液0.02 mL、β-巰基乙醇0.02 mL溶于PB緩沖液，定容于20 mL)，搖勻，30 ℃水浴10 min后，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，再加入1 mL 2.5%的蝸牛酶溶液，搖勻，35 ℃水浴1 h，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，最后加入1 mL高滲緩沖液(5.2 g KCl溶于PB緩沖液，定容至100 mL)中得原生質(zhì)體懸液.

(2)原生質(zhì)體的融合

取兩種原生質(zhì)體1 mL，紫外滅活3 min，黑暗中保存20 min，將二者混合，2 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 mL PEG-CaCl2促融劑(PEG6000 8 g、CaCl20.9 g、β-巰基乙醇0.04 mL溶于PB緩沖液，定容至20 mL)，震蕩搖勻，30 ℃水浴20 min，立即用高滲緩沖液稀釋菌體[9].

(3)融合子的篩選

①生長性能篩選：取融合子懸液0.5 mL，涂布于固體蔗糖高滲培養(yǎng)基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，15%蔗糖，2%瓊脂粉，pH7.2)上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，隨機挑選生長較快、長勢較好的菌株，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h.

②耐高溫篩選：將基于生長性能篩選獲得的初篩菌株，連同作為陽性對照和陰性對照的多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌，接種于固體蔗糖高滲培養(yǎng)基上，在48 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，篩選能耐高溫的菌株，該實驗步驟可達到排除粟酒裂殖酵母，得到酵母融合子和多形漢遜酵母的目的.

③鉬酸鈉和乙醇耐受性篩選：將生長性能良好、耐高溫的融合子，連同作為陰性對照和陽性對照的多形漢遜酵母菌株和粟酒裂殖酵母菌株，將經(jīng)梯度稀釋后的菌液接種于乙醇(4%)選擇固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，轉接在鉬酸鈉(2.5 mmol/L)選擇固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，可獲得具有鉬酸鈉和乙醇耐受性的融合子，該實驗步驟可實現(xiàn)排除多形漢遜酵母，得到酵母融合子的效果[10,11].

(4)融合子遺傳穩(wěn)定性

將性能優(yōu)良的GSH高產(chǎn)融合子，接種到液體YPD培養(yǎng)基中，37 ℃，130 r/min，恒溫培養(yǎng)，每48 h傳一代，連續(xù)傳8代，依次對每一代進行GSH含量的檢測[12].

1.2.2 DTNB方法檢測GSH產(chǎn)量

按照參考文獻[13]的方法進行操作，分別取融合子、多形漢遜酵母和粟酒裂殖酵母的新鮮發(fā)酵液5 mL，離心得上清液和細胞沉淀.上清液用于測定胞外GSH的含量，細胞用于測定胞內(nèi)GSH的含量，GSH的總含量為二者之和.

細胞干重測定方法為將發(fā)酵液離心后，蒸餾水洗滌2～3次，在85 ℃烘干至恒重，稱重.在新鮮發(fā)酵液離心得到的上清液和菌體細胞經(jīng)破壁處理后得到的上清液中，分別加入1.5 mL 0.06% NaOH和0.5 mL 0.03%甲醛，搖勻，靜止2 min，再加入2.5 mL DTNB分析液(1 mL 0.01 mol/L DTNB溶液與99 ml 0.25 mol/L Tris-Hcl緩沖液混合，pH8.0)，搖勻，25 ℃水浴5 min，測412 nm吸光值.再根據(jù)吸光度與GSH濃度的關系計算出樣品中GSH的含量[14].

1.2.3 酵母融合子的發(fā)酵工藝

將酵母融合子接種至YPD培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)18h.取對數(shù)增長期的酵母液進行GSH含量測定.

(1)發(fā)酵條件的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，設置正交試驗，確定最佳組合方式.運用極差分析法對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，確定最佳發(fā)酵工藝.選定發(fā)酵時間、接種量、碳源(葡萄糖)添加量和氮源(酵母浸粉)添加量為4個考察因素，每個因素分為3個水平，以GSH產(chǎn)量為考察指標，因素水平見表1所示[15].

表1 正交試驗因素水平表

(2)培養(yǎng)溫度

①恒溫發(fā)酵試驗:溫度對微生物的生長及其代謝產(chǎn)物合成有明顯影響，本實驗設置不同溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、49 ℃)條件下恒溫發(fā)酵48 h，每隔6 h取樣一次，測定細胞干重(DCW)及GSH產(chǎn)量.

②變溫發(fā)酵試驗:由于高溫條件對菌體具有一定的脅迫作用，可根據(jù)恒溫發(fā)酵試驗結果，設計變溫條件，以提高GSH產(chǎn)量.

2 結果與討論

2.1 培養(yǎng)溫度酵母融合子的制備

2.1.1 培養(yǎng)溫度高溫篩選

由于裂殖酵母的最高耐受溫度為46 ℃，而漢遜酵母的最高耐受溫度為50 ℃，所以在48 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h，可去除粟酒裂殖酵母.如圖1所示，在48 ℃恒溫培養(yǎng)條件下，多形漢遜酵母菌可順利生長且長勢較好，粟酒裂殖酵母菌無法生長，初篩得到的融合子在48 ℃恒溫培養(yǎng)條件下能正常生長.

(a)多形漢遜酵母 (b)粟酒裂殖酵母 (c)初篩得到的融合子圖1 菌體在48 ℃恒溫培養(yǎng)條件下的生長情況

2.1.2 鉬酸鈉和乙醇抗性篩選

如圖2所示，在乙醇和鉬酸鈉選擇固體培養(yǎng)基中，多形漢遜酵母菌和酵母融合子長勢均較好，而粟酒裂殖酵母菌均無法生長，可篩出具有乙醇和鉬酸鈉耐受性的菌株，即可以進一步去除多形漢遜酵母，得到目標GSH高產(chǎn)酵母融合子.

(a)乙醇選擇固體培養(yǎng)基 (b)鉬酸鈉選擇固體培養(yǎng)基圖2 酵母融合子在選擇培養(yǎng)基上的生長情況

2.1.3 DTNB法檢測GSH的含量

由表2可知，DTNB法測得35#和67#酵母融合子的GSH產(chǎn)量均高于多形漢遜酵母出發(fā)菌株和粟酒裂殖酵母出發(fā)菌株.

表2 融合子的GSH產(chǎn)量

2.1.4 融合子穩(wěn)定性分析

從以35# GSH高產(chǎn)融合子為發(fā)酵菌株，連續(xù)傳8代，對每一代進行GSH含量的檢測.由圖3可知，35#菌株的GSH產(chǎn)量下降大致在10%之內(nèi)，表明該高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定.

圖3 GSH高產(chǎn)融合子遺傳性

2.2 酵母融合子的發(fā)酵工藝研究

2.2.1 正交試驗結果

由表3可知，各因素極差順序為RB>RD>RC>RA，影響因子先后順序為接種量>酵母浸粉>葡萄糖>接種時間，各因素最佳組合為A2B2C2D3，即接種時間為18 h，接種量為4%，葡萄糖為30 g/L，酵母浸粉為15 g/L.

表3 L9(34)正交試驗結果

2.2.2 驗證試驗

為了驗證所得試驗結果的準確性，將最佳發(fā)酵條件組合A2B2C2D3(接種時間為18 h，接種量為4%，葡萄糖為20 g/L，酵母浸粉為20 g/L)與正交試驗中A1B2C2D2(接種時間為17 h，接種量為4%，葡萄糖為20 g/L，酵母浸粉為15 g/L)進行對比驗證試驗.如表4所示，2種方案對比驗證后發(fā)現(xiàn)，在最優(yōu)發(fā)酵條件下所得的GSH產(chǎn)量高于正交試驗中的2號組合，說明經(jīng)過正交試驗篩選得出的條件組合可信.

表4 對比驗證試驗結果

2.2.3 培養(yǎng)溫度對GSH產(chǎn)量的影響

(1)恒溫發(fā)酵試驗

如圖4～5所示，溫度對DCW和GSH產(chǎn)量有著一定的影響.由圖4可見，當培養(yǎng)溫度為30 ℃時，DCW高達到6.2 g/L；從圖5可見，當培養(yǎng)溫度為37 ℃時，GSH產(chǎn)量高達489.6 mg/L.37 ℃時GSH產(chǎn)量相比于30 ℃時提高了3.69倍，但是，其DCW卻下降了56.4%.由此可見，GSH高產(chǎn)酵母融合子的最適生長溫度與發(fā)酵生產(chǎn)GSH的溫度不同，表明可通過變溫發(fā)酵試驗來提高酵母融合子生物合成GSH的能力.

圖4 溫度對菌體生物量的影響

圖5 溫度對GSH產(chǎn)量的影響

(2)變溫發(fā)酵試驗

由于細胞在高溫條件下可受到脅迫作用，且該酵母融合子屬于一種耐高滲酵母，當溫度升高時，細胞脫水形成高滲環(huán)境，這為酵母發(fā)酵生產(chǎn)應激產(chǎn)物GSH提供了動力.所以，本實驗設計變溫發(fā)酵試驗，將酵母融合子在最適生長溫度30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，再升溫至最適發(fā)酵溫度37 ℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h.此外，將酵母融合子在最適生長溫度30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，再升溫至脅迫溫度49 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，再降溫至最適發(fā)酵溫度37 ℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h.如表5所示，結果表明兩者變溫發(fā)酵策略都可以提高GSH產(chǎn)量.

表5 變溫發(fā)酵后的DCW和GSH的產(chǎn)量

3 結論

該融合子是來源于多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌，兩個親本在生理生化方面有著一定的差異，但融合子整合了兩個親本的生長性能.

GSH高產(chǎn)酵母融合子的篩選方法主要為耐高溫篩選和乙醇、鉬酸鈉耐受性篩選.在耐高溫篩選實驗中，由于多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌的最高耐受溫度分別為50 ℃和46 ℃，所以在48 ℃培養(yǎng)時，多形漢遜酵母菌和酵母融合子長勢均較好，而粟酒裂殖酵母菌均無法生長.可排除粟酒裂殖酵母菌的存在，說明在耐高溫特性上，融合子表現(xiàn)出多形漢遜酵母菌特點，而在乙醇和鉬酸鈉耐受性篩選實驗中，粟酒裂殖酵母可順利生長，多形漢遜酵母菌無法生長，從而可排除多形漢遜酵母菌的存在，表明在鉬酸鈉和乙醇耐受性篩選實驗中，融合子表現(xiàn)出粟酒裂殖酵母菌生長特性.

從以上的實驗結果可以看出，35#和67# 融合子是由多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌融合得到的.這表明PEG法融合多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌是行之有效的方法.融合子在生長方面具有多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌的特性，其遺傳物質(zhì)也來自于兩親本.本實驗結果表明利用原生質(zhì)體融合方法構建的融合子生產(chǎn)GSH的能

力均強于兩個親本，加上其遺傳背景清晰、遺傳操作簡單的特性，這為后續(xù)分子定向改良GSH生產(chǎn)性能提供了實踐依據(jù).

[1] 袁爾東，鄭建仙.功能性食品基料——谷胱甘肽的研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1999,25(5):52-57.

[2] 閆慧芳,毛培勝,夏方山.植物抗氧化劑谷胱甘肽研究進展[J].草地學報,2013,21(3):428-434.

[3] 黃景春,梁立冰.還原型谷胱甘肽的生產(chǎn)方法及其應用[J].輕工科技,2013(1):10-12.

[4] 孫金旭.釀酒酵母谷胱甘肽發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究[J].衡水學院學報,2011,13(1):116-118.

[5] 黎 明,池 嬌,張 波,等.高產(chǎn)谷胱甘肽酵母菌篩選及發(fā)酵條件研究[J].食品與發(fā)酵科技,2013,49(2):10-12.

[6] 聶 敏.發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽及其高產(chǎn)策略研究[D].蘇州：蘇州大學，2010.

[7] 錢衛(wèi)東,施春陽,王 婷,等.多形漢遜酵母作為細胞工廠的應用研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012,39(4)：55-56.

[8] 劉玉嶺,柳云帆,謝建平.粟酒裂殖酵母全基因組中含信號肽蛋白質(zhì)的研究[J].遺傳,2007,29(2):250-256.

[9] 黎永學,張德純,李代昆.雙歧桿菌和釀酒酵母原生質(zhì)體融合子篩選方法的探討[J].食品科學，2006,27(2):84-86.

[10] Francesco Mezzetti,Luciana Da Vero,Paolo Giudici.Evolved saccharomyces cerevisiae wine strains with enhanced glutathione production obtained by an evolution-based[J].Fems Yeast Research,2014,14:977-987.

[11] Dorota Grabek Lejko,Olena O Kurylenko,Vladimir A Sibirny,et al.Alcoholic fermentation by wild-type Hansenula polymorpha and saccharomyces cerevisiae versus recombinant strains with an elevated level of intracellular glutathione[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2011,38(11):1 853-1 859.

[12] 錢衛(wèi)東，趙德志，付云芳,等.一步重組法構建產(chǎn)龍膽苦苷酵母重組菌的研究[J].陜西科技大學學報(自然科學版)，2014,32(5):123-128.

[13] 錢衛(wèi)東,付云芳.利用變溫提高漢遜酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的研究[J].食品工業(yè)科技,2013,34(6):207-210.

[14] 攀躍平,于健春,余 躍,等.谷胱甘肽的生理意義及其各種測定方法比較、評價[J].中國臨床營養(yǎng)雜志,2003,11(2):136-139.

[15] 李 寅,陳 堅,周楠迪,等.環(huán)境條件及搖瓶補糖策略對谷胱甘肽發(fā)酵的影響[J].生物工程學報,1998,14(2):147-152.

【責任編輯：蔣亞儒】

Preparation and fermentation process of GSH high-yield yeast fusant

QIAN Wei-dong1， WU Qi-hang1， LIU Yu-chen1, WANG Ting2， MAO Pei-hong3

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi Unversity of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.College of Life Sciences, Northwest University, Xi′an 710069, China; 3.School of Physics and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

To construct glutathione (GSH) high-yield yeast fusant,the fusants were derived from protoplast fusion betweenHansenulapolymorphaandSchizosaccharomycespombeby polyethylene glycol(PEG) fusion method.Based on-high temperature screening was adopted in prescreening,and ethanol and Sodium molybdate culture medium were utilized in second screening.Then GSH content was determined by 5,5′-Dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)(DTNB).Finally,the genetic stability of the glutathione (GSH) high-yield yeast fusants was analyzed.One GSH yeast fusant strain high-yield and genetic stability was constructed.Therefore,a breeding strategy based on the protoplast fusion method would be a valuable alternative to improve glutathione production.

Hansenulapolymorpha；Schizosaccharomycespombe； protoplast fusion； fusant

2016-12-11 基金項目：國家自然科學基金項目(11575149); 陜西省科技廳自然科學基礎研究計劃項目(2016JM3020); 陜西省教育廳專項科研計劃項目(15JK1088)

錢衛(wèi)東(1980-)，男，安徽蕪湖人，副教授，博士，研究方向：高附加功能性有效成分開發(fā)

1000-5811(2017)02-0126-05

R284.1

A