蝙蝠葛葉總黃酮提取工藝優化及體外抗氧化活性研究

孔 陽， 馬養民， 彭 歡

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021; 2.陜西科技大學 化學與化工學院， 陜西 西安 710021)

蝙蝠葛葉總黃酮提取工藝優化及體外抗氧化活性研究

孔 陽1， 馬養民2， 彭 歡1

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021; 2.陜西科技大學 化學與化工學院， 陜西 西安 710021)

對超聲波輔助提取蝙蝠葛葉總黃酮的最佳工藝條件以及總黃酮的抗氧化活性進行了研究.采用正交試驗法篩選蝙蝠葛葉總黃酮最佳提取工藝.結果表明，最佳超聲波提取工藝是功率150 W，乙醇濃度60%，料液比1∶20，提取時間60 min.抗氧化活性結果顯示蝙蝠葛葉總黃酮具有較好的DPPH自由基清除能力.

蝙蝠葛; 黃酮; 正交試驗法; 抗氧化活性

0 引言

蝙蝠葛(MenispermumdahuricumDC.)系防己科蝙蝠屬植物，又名蝙蝠藤、山豆秧、黃條香、野

豆根等，為多年生草本攀緣植物.在我國主要分布于東北、華北、華中、華東等地，陜西省北部及秦嶺北坡也有分布，多生于海拔1 500 m以下的田邊或石礫灘地，《本草綱目拾遺》稱其干燥根莖為“北豆根”[1,2].

研究表明，北豆根中含有蝙蝠葛堿、蝙蝠葛諾林堿、蝙蝠葛新諾林堿、蝙蝠葛可林堿、蝙蝠葛蘇林堿、N-去甲基蝙蝠葛堿、粉防己堿、青藤堿等三十多種生物堿及異槲皮素、黃芪苷等多種黃酮類化學成分[3,4].北豆根性味苦寒，有小毒，具有清熱解毒，消腫利咽，抗癌、祛風止痛等功效.臨床廣泛用于治療癌癥、咽喉腫痛、風濕痹痛、心腦血管疾病等病癥[5-13].北豆根藥用價值顯著，原料的需求量很大.然而，人們只取其根部作藥用卻廢棄莖葉部分，資源破壞嚴重.文獻表明，蝙蝠葛莖葉中也含有黃酮類、生物堿、萜類等多種有效成分[14,15]，但是有關蝙蝠葛葉中總黃酮提取工藝的研究還未見報道.超聲波作用于液體產生空化作用，能夠使生物細胞壁破壞，從而加強細胞內物質擴散到溶劑中[16].因此本實驗對超聲波輔助提取蝙蝠葛葉總黃酮的最佳提取工藝進行研究，并對所得總黃酮的抗氧化活性進行了考察.

1 材料與方法

1.1 材料

蝙蝠葛于2015年8月采自西安翠華山，經楊文娟講師鑒定為蝙蝠葛(MenispermumdauricumDC.)，新鮮的蝙蝠葛葉片經120 ℃殺青10 min后，在35 ℃烘干粉碎過20目篩備用.

1.2 儀器與試劑

(1)主要儀器：BILON-1000CT型多用途恒溫超聲波提取機(上海比朗儀器有限公司)，HF2000酶標儀(北京華安麥科生物技術有限公司)，S200 baygene移液槍(北京百晶生物技術有限公司)，3590 costar 96孔酶標板(美國Corning Costar公司)，HC-3618R型高速冷凍離心機(安徽中科儀器有限公司)，RE-52A型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠).

(2)主要試劑：蘆丁對照品(中國國藥集團)，DPPH和維生素C(天津市博迪化工有限公司)，其余試劑均為分析純.

1.3 超聲波輔助提取總黃酮方法

1.3.1 超聲提取工藝流程

蝙蝠葛葉粉→加入溶劑→超聲波處理→離心→收集上清液→減壓蒸餾→粗黃酮浸膏.

1.3.2 供試品溶液制備

精密稱取陰干蝙蝠葛莖葉5 g，加入100 mL 60%乙醇，超聲波提取60 min后過濾得濾液，定量轉入100 mL容量瓶內，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液.

1.3.3 標準曲線的制備

精密吸取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 、6.0 mL置于25 mL容量瓶中，各加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加1% (ρ) AlCl3溶液3 mL，搖勻，放置6 min，加4% (ρ) NaOH溶液10 mL，搖勻，放置15 min，加水至刻度，第一個樣品為空白對照，在510 nm波長處測定吸光度，以蘆丁對照品的質量濃度(ρ)為橫坐標，吸收度(A)為縱坐標作標準曲線，并進行線性回歸.

1.3.4 穩定性試驗

精密吸取對照品溶液與供試品溶液適量，按標準曲線項下操作顯色，10 min后測定其吸光度，以不同的時間間隔測定樣品的吸光度，觀察其穩定性[17].

1.3.5 精密度試驗

精密吸取供試品溶液0.5 mL，按標準曲線項下操作顯色，測定吸光度5次，計算總黃酮得率，結果為2.54%，2.53%，2.54%，2.53%，2.54%，蝙蝠葛莖葉中總黃酮的平均得率為2.54%，RSD=0.19%.

1.3.6 樣品總黃酮含量的測定

總黃酮含量以蘆丁為對照品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定[17-19],按照公式(1)計算總黃酮含量：

x=y×V×F/M

(1)

式(1)中：x—樣品中總黃酮含量(mg/g);y—由回歸方程算得的樣液濃度(mg/mL);V—定容體積(mL);F—稀釋倍數；M—樣品量(g).

1.3.7 單因素考察

分別研究乙醇濃度、超聲功率、提取時間、提取溫度、料液比5個因素對蝙蝠葛總黃酮得率的影響.考察因素的選取范圍，超聲功率100～200 W，乙醇濃度0%～80%(V)，提取時間40～80 min，提取溫度40 ℃～100 ℃，料液比1∶8～1∶24.

1.3.8 正交試驗優選提取工藝

通過單因素考察，確定正交試驗中提取溫度設定在80 ℃,以保證得率并避免溫度過高導致蝙蝠葛葉中部分黃酮類化合物在高溫下分解.在單因素考察結果的基礎上，確定乙醇濃度、超聲波功率、提取時間、料液比四個因素作為得率的影響因子，設計L9(34)4因素3水平正交試驗，篩選最佳提取工藝，如表1所示.

表1 正交試驗因素水平表

1.4 抗氧化活性試驗方法

以Vc作為參照，對蝙蝠葛葉總黃酮進行抗氧化性測試[20]，抗氧化性能強弱根據樣品對DPPH自由基清除率來判斷，清除率可由公式(2)進行計算：

(2)

式(2)中：E—自由基清除率，A0—DPPH和甲醇混合溶液吸光度，A1—第二排1-11孔所對應的吸光度，A2—第一排1-11孔所對應的吸光度.

按照公式(2)計算出不同樣品濃度下的自由基清除率，以濃度為橫坐標，清除率為縱坐標，繪制清除率變化曲線，對其增長部分進行線性擬合，按照擬合方程計算出樣品對DPPH自由基率的IC50值，Vc按照同樣方法進行檢測.

2 結果與討論

2.1 超聲波輔助提取工藝優化結果

2.1.1 標準曲線

根據實驗數據，以蘆丁對照品的質量濃度(ρ)為橫坐標，吸收度A為縱坐標得到標準曲線(如圖1所示)，并進行線性回歸，得到回歸方程：

蘆丁標準曲線線性回歸方程為：

y=12.054x+0.000 5R2=0.999 8

y—對照品溶液吸光度，x—對照品溶液質量濃度，蝙蝠葛葉總黃酮濃度為0.01～0.07 mg/ml時呈良好的線性關系.

圖1 標準曲線

2.1.2 穩定性試驗結果

穩定性實驗結果如圖2所示，對照品蘆丁與供試品在30 min之內穩定性良好，但隨著時間的延長，供試品的吸光值均逐漸減小， 40 min后，供試品吸光值顯著降低，說明供試品較對照品更不穩定，因此吸光值的測定應在30 min以內完成.

圖2 穩定性實驗結果

2.1.3 單因素考察結果

(1)超聲波功率對得率的影響

超聲波功率對蝙蝠葛葉總黃酮得率的影響如圖3所示，蝙蝠葛葉中總黃酮的得率隨超聲波功率的增大而明顯增大，在200 W處達到了最大值.

圖3 超聲波功率對得率的影響

(2)乙醇濃度對得率的影響

乙醇濃度對蝙蝠葛葉總黃酮得率的影響如圖4所示.總黃酮的得率隨乙醇濃度的升高明顯增加，在乙醇濃度60%處得率達到最大，之后逐漸降低.

圖4 乙醇濃度對得率的影響

(3)料液比對得率的影響

料液比對得率的影響結果如圖5所示.蝙蝠葛葉中總黃酮的得率隨料液比的增加而逐漸增加，當料液比達到1∶20后，得率變化不大，同時考慮到料液比過高會增加后期藥液濃縮的難度，因此在正交試驗中設定三個水平為1∶10、1∶15、1∶20.

圖5 料液比對得率的影響

(4)提取時間對得率的影響

提取時間對得率的影響如圖6所示.蝙蝠葛葉中總黃酮的得率隨提取時間的延長而增加，80 min時得率最大，之后隨著時間的增加得率有所下降.

圖6 提取時間對得率的影響

(5)提取溫度對得率的影響

提取溫度對得率的影響如圖7所示.隨著提取溫度的升高，蝙蝠葛莖葉中總黃酮的得率隨之上升且增加幅度較大，80 ℃時得率最高，溫度繼續升高時得率有所下降，分析其原因可能是由于溫度過高會影響總黃酮的穩定性，因此在正交試驗考察中選用80 ℃為提取溫度，以避免溫度過高導致部分黃酮類化合物分解.

圖7 溫度對得率的影響

2.1.4 正交試驗法優選提取工藝

精密稱取蝙蝠葛莖葉5 g，按表1 L9(34)正交試驗因素水平表對蝙蝠葛莖葉進行超聲波提取工藝優化，結果如表2所示.

表2 正交試驗結果

從極差分析表明，最佳的提取工藝為A3B2C3D3，所考察的因素影響程度為：乙醇濃度>超聲波功率>提取時間>料液比.對正交試驗結果進行驗證試驗，在條件A3B2C3D3下提取3次，總黃酮的得率分別是：3.70%、3.69%、3.67% ，平均得率為3.69%與正交試驗結果相符.

方差分析結果如表3所示，超聲波功率和乙醇濃度對黃酮得率影響顯著(顯著性水平α=0.05)，而料液比和提取時間的影響不顯著.綜合比較得最佳工藝為超聲波功率250 W，乙醇濃度60%，料液比1∶20，提取時間80 min.

表3 正交試驗及結果

2.2 蝙蝠葛葉總黃酮體外抗氧化活性測試結果

將提取得到的蝙蝠葛葉總黃酮進行體外抗氧化活性試驗，以Vc作對照，結果如表4所示.從表4可以看出，蝙蝠葛葉總黃酮對DPPH的自由基清除率IC50值(μg/mL)與維生素C相當，具有較好抗氧化活性.

表4 DPPH自由基清除率測試結果

3 結論

本實驗結果表明蝙蝠葛莖葉含有較為豐富的黃酮類化合物，具有較好的體外抗氧化活性，是良好的天然抗氧化劑.同時本文優選出了最佳的超聲波提取工藝，為進一步開發利用蝙蝠葛資源提供了參考依據.

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【責任編輯：陳 佳】

Study on optimum extraction and antioxidative activity of total flavonoids from the Leaf ofMenispermumdahuricumDC.

KONG Yang1， MA Yang-min2， PENG Huan1

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

The paper is about the ultrasonic assisted extraction optimum process conditions and antioxidative activity of total flavonoids from Leaves ofMenispermumdahuricumDC.Orthogonal test method was used to select the optimum extraction technology.The results show the optimal process is power 150 W,ethanol concentration 60%,solid-liquid ratio 1∶20,extraction time 60 min.Antioxidant activity results show that the total flavonoids has good DPPH radical scavenging capacity.

MenispermumdahuricumDC.; flavonoids; orthogonality; antioxidative activity

2016-12-15 基金項目：陜西省教育廳自然科學專項科研計劃項目(2013JK0726)

孔 陽(1980-)，女，山東曲阜人，講師，在讀博士研究生，研究方向：天然產物化學

1000-5811(2017)02-0121-05

R284.2

A