Smad7 mRNA和NF—κBp65 mRNA及其蛋白在肝癌患者中的表達

王曉蔚++康凱夫++羅小麗

[摘要]目的 分析Smad7與NF-κBp65在原發性肝細胞性肝癌（HCC）中的表達、臨床意義及兩者之間的關系。方法 選擇2005年12月～2010年12月順德第一人民醫院外科手術切除送檢至病理科的臘塊標本120例為研究對象，其中正常肝組織10例、肝炎組織30例、肝硬化組織30例、HCC組織50例。采用免疫組化S-P法和石蠟切片原位雜交法檢測各肝組織中Smad7 mRNA、NF-κBp65 mRNA及其蛋白的表達情況。結果 Smad7蛋白、NF-κBp65蛋白、Smad7 mRNA、NF-κBp65 mRNA在HCC組織中的陽性表達率均明顯高于肝硬化、肝炎和正常肝組織（P<0.01）。肝硬化組織中Smad7 mRNA、Smad7蛋白的陽性表達率明顯高于正常肝組織（χ2=4.043、4.848，均P<0.05）。HCC中NF-κBp65蛋白的表達與腫瘤直徑及Smad7蛋白的表達有關（χ2=5.592、4.578，均P<0.05）。結論 Smad7和NF-κBp65異常表達可能共同參與了HCC的演進。

[關鍵詞]Smad7；核因子NF-κB；免疫組化；原位雜交

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（a）-0008-04

[Abstract]Objective To study the expression of Smad7 and NF-κBp65 in HCC and their relationship.Methods 120 cases of specimen from patients carried surgical resection in the First People′s Hospital of Shunde of Southern Medical University from December 2005 to December 2010 were selected as the research object，including 10 cases of normal hepatic tissues，30 case of cirrhosis，30 cases of hepatitis and 50 cases of HCC.Immunohistochemistry and in situ hybridization were used to detect the changes of Smad7 mRNA and NF-κBp65 mRNA and their proteins expressions in each kinds of hepatic tissues.Results The positive expressions rate of Smad7 mRNA and NF-κBp65 mRNA and their protein in HCC tissues were significantly higher than those in the cirrhosis tissues，hepatitis tissues and normal hepatic tissues，the differences were statistically significant （P<0.01）.The expression of Smad7 mRNA and proteins in cirrhosis tissues were higher than those in normal tissues （χ2=4.043，4.848，all P<0.05）.The expression of NF-κBp65 protein in hepatocellular carcinoma was related to tumor size and the expression of Smad7 protein （χ2=5.592，4.578，all P<0.05）.Conclusion The abnormal expression of Smad7 and NF-κBp65 may be related to the evolution of HCC.

[Key words]Smad7；Nuclear factor-kappa B；Immunohistochemistry；In situ hybridization

肝細胞癌的死亡率在惡性腫瘤中位居第三，約占成年人原發性肝臟腫瘤80%，其發病率也居高不下[1-2]，且肝細胞癌患者早期癥狀不明顯，經常延誤診斷，從而使其治療方法非常有限[3]，主要是手術切除及肝移植。雖然原發性肝細胞性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，HCC）的發生和發展被認為與肝炎、肝硬化有關，但還不清楚其中的分子機制。目前認為，HCC的發生演變可能是一個多基因、多步驟的過程，Smad7是TGF-β下游非常重要的信號蛋白，被認為與器官硬化和腫瘤發生有關。核因子-κBp65（nuclear factor-kappa Bp65，NF-κBp65）的活化已被證實在多種腫瘤細胞中存在。本研究通過檢測HCC組織中Smad7和NF-κBp65的表達，探討其輔助臨床診斷及治療的價值。

1對象與方法

1.1對象

選擇2005年12月～2010年12月順德第一人民醫院外科手術切除送檢至病理科的臘塊標本120例為研究對象，其中正常肝組織10例、肝炎組織30例、肝硬化組織30例、HCC組織50例。HCC患者按照Edmondson標準分級，Ⅰ～Ⅱ級24例，Ⅲ～Ⅳ級26例；年齡28～71歲，平均56.5歲；男47例，女3例。肝硬化患者年齡25～69歲，平均50.6歲；男22例，女8例。慢性肝炎患者中，輕、中、重度慢性肝炎各10例；年齡6～51歲，平均34.8歲；男28例，女2例。切片厚度均為4 μm。正常對照肝組織采用經病理科HE染色，切片被診斷并證實為未發生病變的成人肝臟臘塊標本再重新切片獲得。

1.2方法

鼠單抗NF-κBp65購自美國Santa Crus公司，鼠單抗Smad7、Smad7 mRNA和NF-κBp65 mRNA原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。應用免疫組化S-P法，實驗步驟按說明書進行，DAB顯色5 min。陽性對照由試劑公司提供，陰性對照由PBS緩沖液代替一抗作參照。原位雜交方法：石蠟切片常規脫水、浸蠟、包埋。氨丙基三乙氧基硅烷處理玻片，脫蠟至水，暴露核酸片段，后固定，預雜交，雜交（過夜），洗滌，封閉，滴加生物素化鼠抗地高辛等，EAC顯色后依次進行常規步驟，最后封片[4]。

1.3結果判定標準

采用雙盲法對兩種染色結果進行觀察[5]，每張切片隨機選擇5個高倍視野（×400），隨機選取200個實質細胞，計算陽性細胞占比，最后計分：≤25%記1分，>25%～75%記2分，>75%記3分。將染色強度分為3級：陰性著色1分，弱著色2分，棕黃色3分；采用半定量積分法，根據兩者的乘積判斷結果，≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或四格表概率法，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 各肝組織中Smad7蛋白與NF-κBp65蛋白的表達情況

Smad7蛋白在HCC中的陽性表達率均明顯高于肝硬化、肝炎及正常肝組織，差異均有統計學意義（χ2=6.036、19.217、17.286，均P<0.01）；NF-κBp65蛋白在HCC中的陽性表達率均明顯高于肝硬化、肝炎及正常肝組織，差異均有統計學意義（χ2=10.889、14.854、8.440，均P<0.01）。Smad7蛋白在肝硬化組織中的陽性表達率明顯高于在正常肝組織（χ2=4.848，P<0.05）（表1）。

2.2 Smad7 mRNA和NF-κBp65 mRNA在各肝組織中的表達情況

Smad7蛋白在HCC中的陽性表達率均明顯高于肝硬化、肝炎及正常肝組織，差異均有統計學意義（χ2=5.524、16.254、16.000，均P<0.01）；NF-κBp65蛋白在HCC中的陽性表達率均明顯高于肝硬化、肝炎及正常肝組織，差異均有統計學意義（χ2=8.233、15.761、10.413，均P<0.01）。Smad7 mRNA在肝硬化中的表達明顯高于在正常肝組織中的表達（χ2=4.043，P<0.05）（表2、圖1）。

A.Smad7蛋白在HCC組織中的表達（SP，×400）；B.Smad7 mRNA在HCC組織中的表達（SP，×400）；C.NF-κBp65 蛋白在HCC組織中的表達（SP，×200）；D.NF-κBp65 mRNA在HCC組織中的表達（SP，×200）；箭頭所示為陽性表達細胞

2.3 Smad7和NF-κBp65在HCC組織的表達與相關臨床病理因素的關系

Smad7蛋白在HCC中的陽性表達與各因素均無關（P>0.05）；NF-κBp65蛋白在HCC中的陽性表達與腫瘤直徑有關（P<0.05），而與年齡、Edmondson分級、HBsAg、轉移情況無關（P>0.05）（表3）。

2.4 HCC中Smad7蛋白和NF-κBp65蛋白表達的關系

HCC組織中Smad7蛋白與NF-κBp65蛋白的表達密切相關（χ2=4.578，P=0.02）（表4）。

3討論

轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族是一種具有重要生物效應的細胞因子，有三種亞型（TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3），在細胞的生長、分化、遷移、凋亡、免疫調節等方面發揮重要的調節作用。其中含量最高的是TGF-β1，它可以活化和促進血管生成相關因子的表達，促進腫瘤中血管系統形成，從而促進腫瘤的發展[6]。有研究報道在多種惡性腫瘤中TGF-β1高表達[7-8]。Smads蛋白家按功能分為3類：受體活化型Smad（R-Smads）、共同通路型Smad（Co-Smad）和抑制性Smad（I-Smads）。Smad 7屬于抑制型I-Smads，抑制TGF-β家族的信號轉導。本研究結果顯示，在4種肝組織中，Smad7蛋白及其mRNA的表達率有明顯差異性，在HCC中的表達明顯高于其他3種組織。主要是由于Smad7作為TGF-β1信號轉導通路的抑制元件，通過干擾Smad2、Smad3的磷酸化和Smad-2，3，4異源復合物的形成而發揮作用，導致細胞的無限制生長[9]。即Smad7的高表達通過反饋調控使TGF-β1對細胞生長、增殖的抑制能力降低，加速細胞的惡性轉化[10]。有研究顯示Smad7基因與結腸癌患預后有著密切的關系，Smad7高表達被認為是惡性細胞抑制TGF-β的生長作用的機制之一[11-12]。有研究還提示，不依賴TGF-β，Smad7可發揮獨立分子生物學作用，并在腫瘤細胞的凋亡中發揮重要作用[13-15]。由于在肝硬化中的表達明顯高于正常肝組織中，研究表明TGF-β1還可使細胞外基質膠原含量增加，促使膠原纖維和纖維蛋白的形成[16-17]，而抑制因子Smad7主要通過阻斷TGF-β的激活及其信號的轉導，發揮反饋調節功能，抑制器官纖維化與硬化。

核因子NF-κB 是炎癥與癌的重要中介分子，許多細胞、病毒的基因組中存在κB位點，因而眾多基因轉錄可以被NF-κB 調控[18-20]，如肝臟炎性反應相關基因、肝炎病毒相關基因、原癌基因、抑癌基因等多種基因都可以被其通過多種方式參與表達[21]。而NF-κBp65是哺乳動物細胞5種NF-κB（p65、RelB、C-Rel、p50和p52）中含量最豐富的一種，本研究結果顯示NF-κBp65在HCC組織中的表達明顯高于在其他幾種肝組織中，并與腫瘤直徑有關，且差異有統計學意義（P<0.05）。

分析Smad7和NF-κBp65的關系時發現兩者具有一定的相關性（χ2=4.578，P<0.05），在Smad7蛋白高表達的組織NF-κBp65蛋白也高表達。提示Smad7、NF-κBp65可能共同促進HCC的發生發展，推測其機制可能是由于能結合NF-κB的位點位于多種基因中，包括促使TGF-β1活化的啟動子基因，當TGF-β1表達時，Smad7也上調，而且Smad7可能通過阻礙NF-κB的表達誘發凋亡，或者通過其他通路在惡性腫瘤的發生、發展中發揮功能。本實驗為進一步探討原發性肝細胞性HCC的制病機制及防治提供了相關的理論基礎和實驗依據。并為其診斷和治療提供分子生物學水平的參考。

[參考文獻]

[1]El-Serag HB，Rudolph KL.Hepatocellular carcinoma：epidemiology and molecular carcinogenesis[J].Gastroenterology，2007，132（7）：2557-2576.

[2]李瑞東，周文斌.肝硬化肝細胞癌術后標準殘肝體積與肝功能代償不全的相關性[J].世界華人消化雜志，2014，22（16）：2338-2342.

[3]El-Serag HB，Marrero JA，Rudolph L，et al.Diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma[J].Gastroenterology，2008，134（6）：1752-1763.

[4]沈暉，方秀斌.絲裂原活化蛋白激酶及核因子κB在佐劑關節炎大鼠滑膜中的表達[J].中華風濕病學雜志，2003，7（8）：506-507.

[5]林濤，張云艷，初明，等.γH2AX在HPV16陽性宮頸鱗癌組織中的表達及意義[J].中華微生物學和免疫學雜志，2012， 32（2）：134-139.

[6]Jeon SH，Chae BC，Kim HA，et al.Mechanisms underlying TGF-beta1-induced expression of VEGF and Flk-1 in mouse macrophages and their implications for angiogenesis[J].J Leukoc Biol，2007，81（2）：557-566.

[7]Fitchev PP，Wcislak SM，Lee C，et al.Thrombospondin-1 regulates the normal prostate in vivo through angiogenesis and TGF-beta activation[J].Lab Invest，2010，90（7）：1078-1090.

[8]Ghellal A，Li C，Hayes M，et al.Prognostic significance of TGF-betal and TGF-beta3 in human breast carcinoma[J].Anticancer Res，2000，20（6B）：44-l3.

[9]Pran K，Datta HL，Mossee P，et al.Strap and Smad7 synergize in the TGFβ signaling[J].Mol Cell Biol，1999，20（9）：3157-3167.

[10]姜琳，孫燦林.胰腺癌組織中Smad7、uPA及PAI-1的表達及臨床意義[J].江蘇大學學報，2010，20（6）：527-530.

[11]Kim YH，Lee HS，Lee HJ，et al.Prognitic significance of the expression of smad4 and smad7 in human gastric carcinoma[J].Ann Oncol，2004，15（4）：574-580.

[12]Jiang X，Castelao JE，Vandenberg D，et al.Genetic variations in SMAD7 are associated with colorectal cancer risk in the colon cancer family registry[J].PLoS One，2013，8（4）：e60464.

[13]Hong S，Lee C，Kim SJ.Smad7 sensitizes tumor necrosis factor induced apoptosis through the inhibition of antiapoptotic gene expression by suppressing activation of the nuclear factor kappa-B pathway[J].Cancer Res，2007，67（19）：9577-9631.

[14]Kamato D，Burch ML，Piva TJ，et al.Transforming growth factor-β signalling：role and consequences of Smad linker region phosphorylation[J].Cell Signal，2013，25（10）：2017-2024.

[15]Ishisaki A，Yamato K，Nakao A，et al.Smad7 is an activin inducible inhibitor of activin-induced growth arrest and apoptosis in mouse B cell[J].J Biol Chem，1998，273（38）：24293-24296.

[16]趙煜，曾杰銀.NF-κB在胃癌組織中的表達與臨床病理的相關性研究[J].中國醫藥導報，2015，12（29）：70-73.

[17]邱冰峰，徐方明，徐湯舟，等.膽汁淤積性肝病大鼠肝臟及其膽管上皮細胞轉化生長因子β的表達[J].中國醫藥導報，2016，13（3）：27-30.

[18]Pardali K，Moustakas A.Actions of TGF-beta as tumor suppressor and pro-metastatic factor in human cancer[J].Biochim Biophys Acta，2007，1775（1）：21-62.

[19]劉妍，成軍，王建軍，等.核轉錄因子Rel/NF-KB與乙型肝炎病毒[J].世界華人消化雜志，2004，12（1）：145-148.

[20]王曉蔚，康凱夫.NF-κB與炎癥相關性肝癌[J].國際病理科學與臨床雜志，2008，28（4）：315-318.

[21]El-Serag HB，Rudolph KL.NF-kappa B functions as a tumour promoter in inflammation-associated cancer[J].Nature，2004，431（7007）：461-466.

（收稿日期：2016-11-23 本文編輯：任 念）