HOXA3在乳腺癌組織中的表達及其對患者預后、細胞生物學特性的影響

房德芳,石微,房新建,蘇瓊

(1江蘇省連云港中醫藥高等職業技術學校,江蘇連云港222006;2連云港市第二人民醫院)

HOXA3在乳腺癌組織中的表達及其對患者預后、細胞生物學特性的影響

房德芳1,石微1,房新建2,蘇瓊1

(1江蘇省連云港中醫藥高等職業技術學校,江蘇連云港222006;2連云港市第二人民醫院)

目的研究同源盒基因3(HOXA3)在乳腺癌組織中的表達及其對患者預后、乳腺癌細胞生物學的影響。方法用qPCR法檢測30例乳腺癌組織、癌旁組織中HOXA3 mRNA，同時對TCGA數據庫中的患者根據HOXA3平均值分為HOXA3高表達與低表達，并通過生存分析比較生存率與轉移率的差異。乳腺癌細胞系MCF-7隨后分為CON、siRNA1、siRNA2組，分別轉染無效siRNA、HOXA3 siRNA1、HOXA3 siRNA2小干擾RNA，48 h后通過qPCR、Western blotting法檢測HOXA3 RNA和蛋白表達，篩選出干擾能力較強的siRNA后，將siRNA轉染至MCF-7細胞中，以轉染無效siRNA為CON組，使用Transwell與CCK8檢測細胞遷移與增殖變化，并使用Western blotting法檢測EMT標記物Snail、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白。結果HOXA3 mRNA在癌及癌旁組織中的相對表達量分別為17.50±1.44、1.0±0.05，二者比較，P<0.05。HOXA3蛋白在癌及癌旁組織中的相對表達量分別為13.42±0.18、2.57±0.04，二者比較，P<0.05。HOXA3高表達者整體生存率與轉移率均降低(P均<0.05)。轉染48 h后，CON組、siRNA1組、siRNA2組HOXA3 RNA相對表達量分別為1.0±0.12、0.62±0.01、0.16±0.03，三組比較，P均<0.05。CON組、siRNA2組遷移細胞數量分別為40.57±1.68、18.33±1.01，兩組比較，P<0.05；與CON組比較，siRNA2組增殖能力減弱，P<0.05。與CON組比較，siRNA2組E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)，Vimentin、N-cadherin、Snail蛋白表達降低(P均<0.05)。結論HOXA3在乳腺癌患者癌組織中高表達，且與患者預后、轉移相關，同時HOXA3表達可減弱乳腺癌細胞遷移與增殖，這一作用可能與EMT有關。

乳腺癌；同源盒基因3；上皮-間質轉化；細胞轉移

乳腺癌是女性最為常見的癌癥之一，占新發病例的23%及致死病例的14%[1]，目前來說，盡管對于乳腺癌的早期預防、對敏感基因如BRCA1的缺失進行檢測大大提高了乳腺癌患者的5年生存時間，乳腺癌的轉移依然成為一個亟待解決的問題[2]。乳腺癌轉移是一個極其復雜的過程，基本步驟包括癌細胞侵襲周圍組織，并通過內滲進入到循環系統，癌細胞隨后堵塞于毛細血管中，并通過外滲進入到遠隔器官中[3]，在這一過程中，主要的3個步驟內滲、外滲、遠隔器官的生長均需癌細胞能適應相應的微環境，同時能通過上皮-間質(EMT)、間質-上皮(MET)轉換實現侵襲與增殖能力的增加，EMT指細胞具有極性的上皮細胞轉變為間質細胞的過程，EMT后的類間質細胞侵襲、遷移能力明顯增強，同時侵入性偽足形成增多，使得細胞對細胞外基質(ECM)降解能力增強形成[4]，因此EMT過程亦被視為乳腺癌、卵巢癌等癌癥細胞侵襲的重要環節，因此尋找EMT中的關鍵蛋白，并開發特異的抑制劑，從而達到靶向治療的效果已成為研究熱點。同源盒(HOX)基因是一類高度保守并在胚胎發育中發揮重要作用的蛋白，HOX基因共有39種，分為A、B、C、D四類，HOX的主要功能為調控細胞分裂、黏附、增殖與分化[5]，HOX基因的異常表達已在多種腫瘤中如前列腺癌[6]、結腸癌[7]、肺癌[8]等癌癥中得到證實，在乳腺癌中，HOXA5、HOXA9與p53、BRCA1的調節相關[9]，而HOXA1則與乳腺癌細胞的遷移、他莫昔芬治療抵抗相關[10]，而HOXA3在乳腺癌細胞中的表達及作用則尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料 30例人乳腺癌樣本及其相應癌旁組織來自連云港市第二人民醫院，樣本收集過程得到連云港市第二人民醫院倫理委員會批準，人乳腺癌細胞系MCF-7購自北京協和醫學院實驗中心，siRNA由美國Invitrogen公司合成，脂質體購自美國Invitrogen公司，TRIzol購自美國Invitrogen公司，RNA反轉錄試劑盒與Takara SYBR Premix Ex Taq檢測試劑盒購自大連寶生生物公司(Takara)，Transwell小室購自美國Corning公司，HOXA3一抗購自美國Abcam公司，EMT標記物Snail、N-cadherin、Vimentin、 E-cadherin一抗購自美國Cell Signal Technology公司，二抗均購自北京中杉金橋公司，CCK8試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.2 細胞培養 人乳腺癌細胞系MCF-7培養于37 ℃、5%CO2孵箱中，培養基為DMEM+10%FBS，將細胞分為CON、siRNA1、siRNA2組，分別使用脂質體轉染無效siRNA、siRNA1、siRNA2小干擾RNA，CON序列為5′-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3′ ，siRNA1序列為GCATCTTGGCTGTCTGCTAAA，siRNA2序列為GTGTCAAACCCCTGTCAGAGT，脂質體轉染步驟根據Invitrogen公司說明書進行。

1.3 HOXA3 mRNA表達檢測 采用Q-RT-PCR法。細胞總RNA提取使用酚-氯仿抽提法。細胞使用TRIzol裂解后，加入0.5倍體積氯仿，劇烈震蕩后15 000 r/min、離心15 min，取上清。加入等體積異丙醇，冰上沉淀20 min后，12 000 r/min離心10 min，取沉淀。沉淀用75%乙醇洗2次，即得到細胞總RNA。細胞總RNA隨后使用Takara 反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，操作步驟根據Takara反轉錄試劑盒說明書進行，cDNA使用Takara SYBR Premix Ex Taq檢測試劑盒檢測，HOXA3引物序列： 5′-TGCTTTGTGTTTTGTCGAGACTC-3′，5′-CAACCCTACCCCTGCCAAC-3′，內參引物GAPDH：5′-TATGCTCTCCTCATGCATTG-3′,5′-GGGACGACCTTCGATCTACC-3′。使用2-ΔΔCt表示HOXA3 mRNA的表達。

1.4 HOXA3蛋白表達檢測 采用免疫印跡法。細胞經RIPA裂解液裂解后，加入相應體積的Loading buffer，煮沸10 min后，加入到聚丙烯酰胺膠中，濃縮膠80 V，電泳20 min，分離膠100 V電泳40 min，待溴酚藍跑至膠板底側時，裝配轉膜三明治，依次為黑板-濾紙-聚丙烯酰胺膠-活化的PVDF膜-濾紙-白板，濕法轉膜1 h后，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入相應一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，并加入HRP耦聯的二抗，以GAPDH為內參，使用ECL發光液檢測蛋白的表達，蛋白的相對表達量=目的蛋白表達量/GAPDH表達量。

1.5 生存曲線繪制 乳腺癌患者生存曲線數據來源于TCGA公共數據庫，以患者基因表達水平的平均值分組，并使用R語言中survival 包進行生存分析，ggplot2包繪制生存曲線。

1.6 細胞遷移數檢測 采用Transwell 小室檢測細胞遷移能力，Transwell下室加入600 μL完全培養基(DMEM+10%FBS)，上室加入含有1×106細胞的200 μL細胞懸液，14 h后，除去小室上方細胞，下方細胞使用結晶紫染色，顯微鏡20倍視野下對穿過小室的細胞進行計數，實驗重復3次并取平均值。

1.7 細胞增殖能力檢測 采用CCK8法，將MCF-7 CON、siRNA2細胞鋪于96孔板中，5 000/孔，同時設立復孔，待細胞貼壁后，加入0.1體積的CCK8試劑，避光37 ℃ 孵育 3 h后，使用酶標儀檢測OD450，以第0 h的度數為基準，計算24、48、72 h與0 h的比值，即細胞增殖系數。在確定乳腺癌患者HOXA3高表達且與預后相關后，將HOXA3 siRNA轉染至人乳腺癌細胞系MCF-7中，48 h后使用QPCR與Western blotting法檢測HOXA3 RNA與蛋白表達。

1.8 EMT標記物表達檢測 在乳腺癌細胞系MCF-7轉染CON(CON組)與HOXA3(HOXA3組)質粒48 h后，使用Western blotting法檢測EMT標記物Snail、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白。

2 結果

2.1 HOXA3在乳腺癌及癌旁組織中表達比較 HOXA3 mRNA在癌及癌旁組織中的相對表達量分別為17.50±1.44、1.0±0.05，二者比較，P<0.05。HOXA3 蛋白在癌及癌旁組織中的相對表達量分別為13.42±0.18、2.57±0.04，二者比較，P<0.05。

2.2 HOXA3表達與預后間的關系 HOXA3高表達者總體生存率為79.35%、轉移生存率為62.38%，HOXA3低表達者總體生存率為89.63%、轉移生存率為73.26%，兩者比較，P均<0.05。

2.3 HOXA3高表達與乳腺癌細胞系MCF-7遷移和增殖的關系 48 h后CON組、siRNA1組、siRNA2組HOXA3 RNA相對表達量分別為1.0±0.12、0.62±0.01、0.16±0.03，三組比較，P均<0.05。在HOXA3蛋白水平上siRNA1、CON組比較無統計學差異，siRNA2組降低(P<0.05)，因此僅使用siRNA2進行后續實驗。siRNA2轉染至MCF-7 48 h后，使用Transwell檢測遷移的變化，結果顯示CON組、siRNA2組遷移細胞數分別為40.57±1.68、18.33±1.01，兩組比較，P<0.05；而在轉染48 h后使用CCK8檢測增殖能力變化，siRNA2組增殖減弱，且在48、72 h時差異均有統計學意義，P均<0.05。

2.4 EMT標記物表達比較 與CON相比，E-cadherin表達升高，Vimentin、N-cadherin、Snail表達均降低，P均<0.05。

3 討論

乳腺癌的轉移能顯著降低患者生存率、影響患者預后，而多項研究均表明乳腺癌的轉移與EMT密切相關，因此尋找EMT中的關鍵基因并給予靶向治療成為研究熱點。HOX是一類保守的蛋白，盡管如此，HOX對于EMT的作用已有證實，在神經性膠質瘤中，HOXA13被證實能通過激活wnt與TGF-β通路從而促進EMT的發生和影響患者的預后[11]，以往對乳腺癌中HOX家族的研究包括HOXA3、HOXA9、HOXB5、HOXB9等，其中HOXB5與乳腺癌細胞的EMT特性和侵襲、增殖能力密切相關[12]，HOXA3在結腸癌[13]、膠質瘤[14]及惡性淋巴瘤中[15]已被證實表達增高且與疾病的預后相關，而HOXA3在乳腺癌中表達情況鮮有報道。

在本研究中，首先檢測30例乳腺癌患者中癌組織、癌旁組織的HOXA3表達水平，證實了HOXA3在乳腺癌組織中的表達顯著升高，隨后調取TCGA數據庫中乳腺癌患者信息，使用平均值將患者分為HOXA3高表達與低表達組，在對患者總體生存率以及轉移率進行生存分析后發現，HOXA3的高表達使得患者總體生存率、轉移生存率均降低，初步證實了HOXA3的高表達與患者的預后、轉移密切相關。在確定了HOXA3的異常表達后，構建了HOXA3特異性的siRNA，通過QOCR、Western blotting確定HOXA3 siRNA在RNA和蛋白水平的敲低效果，結果表明siRNA2在RNA和蛋白水平均具有更好的敲低效果，因此隨后將siRNA2轉染至乳腺癌細胞系MCF-7中，48 h后使用Transwell與CCK8檢測細胞增殖的變化，結果表明HOXA3的抑制使得MCF-7細胞遷移能力降低、增殖受限，進一步證實了HOXA3對于乳腺癌細胞的遷移、增殖起到重要作用，而隨后檢測EMT相關標記物Snail、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin的變化后發現，E-cadherin表達升高，Snail、N-cadherin、Vimentin表達降低，表明HOXA3對乳腺癌細胞增殖、遷移能力的影響與對EMT的作用相關，Knight等[13]研究結果表明，HOXA3在結腸癌中表達增高，與結腸癌細胞的EMT特性和侵襲、增殖能力密切相關，與本研究結果相似。

綜上所述，HOXA3在乳腺癌患者癌組織中高表達，且與患者預后、轉移相關，同時HOXA3可減弱乳腺癌細胞遷移、增殖，而這一作用可能與EMT有關。

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