結核性腦膜炎患者腦脊液外泌體中let-7d表達的研究

尹慧敏 賈永林 李燕飛 段冉冉 景黎君 滕軍放 賈延劼△

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南開封市中心醫院神經內科 開封 475000

結核性腦膜炎患者腦脊液外泌體中let-7d表達的研究

尹慧敏1)賈永林1，2﹚李燕飛1﹚段冉冉1﹚景黎君1﹚滕軍放1﹚賈延劼1﹚△

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南開封市中心醫院神經內科 開封 475000

目的 探討結核性腦膜炎(tuberculoulous meningitis，TBM)患者腦脊液外泌體的分離及外泌體中let-7d的表達水平及其意義。方法 收集我院15例結核性腦膜炎患者(結腦組，TBM組)，20例病毒性腦膜炎患者(病腦組，VM組)，10例化膿性腦膜炎患者(化腦組，PM組)及20例正常腦脊液患者(對照組)的腦脊液，采取ExoQuick Precipitation 提取法分離并純化外泌體，通過透射電鏡觀察其形態，采用實時熒光定量PCR法檢測其let-7d表達水平。結果 (1)腦脊液中的外泌體，電鏡下呈圓形或茶托狀外形，直徑40～100 nm，實時定量PCR法檢測發現其內含有不同程度表達水平的let-7d；(2)結核性腦膜炎患者腦脊液外泌體中let-7d的表達水平顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；(3)let-7d表達水平結腦組、化腦組與對照組相比均明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)；病腦組與對照組相比也下調，但差異無統計學意義(P>0.05)；(4)let-7d表達水平在化腦組與結腦組相比明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)；(5)let-7d表達水平在結腦組與病腦組相比明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 中樞神經系統感染性疾病的腦脊液中可分離出外泌體，通過比較3種腦炎外泌體中let-7d的表達水平，發現在TBM患者中let-7d的表達水平顯著下調，為其診斷提供潛在的生物學標志物。

結核性腦膜炎；外泌體；分離；let-7d

結核性腦膜炎(TBM)是由結核分枝桿菌引起的中樞神經系統感染性疾病，約占神經系統結核病的70%。目前，診斷主要依靠腦脊液常規生化、細胞學檢查，然而在TBM發生的早期，腦脊液常規生化、細胞學變化多不典型[1]，因此，嚴重影響了TBM的早期診治，故探討TBM的潛在診斷標志物具有重大的臨床意義。

外泌體(exosomes)是一種由細胞主動分泌的大小均一、直徑40～100 nm的膜性囊泡小體，最早是由Pan等[2]從綿羊紅細胞上清液中分離的一種小囊泡，具有脂質雙分子層結構，廣泛存在于血液、尿液、唾液、腦脊液等體液中[3]。其內含有多種蛋白質、mRNA、miRNA等，在不同細胞間進行信息傳遞，發生多種生物功能[4]。外泌體在中樞神經系統中參與正常的生理條件以及介導病理狀態[5]，在中樞神經系統的疾病的發生、發展及損傷修復中起重要作用。

微小RNA(miRNA)是一類內源性非編碼的小分子單鏈RNA，長20～25個氨基酸。具有高度保守性、時序性和組織特異性，其主要功能是從轉錄后水平調節基因的表達，廣泛參與多種生物的生命過程[6]。Let-7家族是miRNA重要的組成部分之一，包含13個成員，其中let-7d在大腦中的表達水平非常高，在多種神經系統疾病中起重要作用，可能成為某些疾病的潛在生物學標志物。本研究通過分離腦脊液中的外泌體，探討let-7d在外泌體中的表達水平及其意義。

1 資料和方法

1．1 臨床資料 選擇2015-01-2016-10就診于鄭州大學第一附屬醫院的住院患者，其中15例結核性腦膜炎患者(結腦組)，男8例，女7例，年齡(31±17.53)歲；20例病毒性腦膜炎患者(病腦組)，男12例，女8例，年齡(35±4.85)歲；10例化膿性腦膜炎患者(化腦組)，男4例，女6例，年齡(40±8.95)歲；20例正常腦脊液患者(對照組)，男9例，女11例，年齡(38±10.51)歲。分別收集各組腦脊液標本。該試驗由鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，并獲得所有受試者或其委托人知情同意。

1．2 入選標準 (1)結腦組：有急性或亞急性腦膜炎的臨床表現，腦脊液檢測到結核分枝桿菌或合并肺結核，伴腦脊液檢測結果符合典型TBM的表現，Xpert MTB/RIF檢測陽性，腦脊液其他細菌、病毒、寄生蟲、腫瘤檢查均陰性，所有患者經抗結核治療有效。(2)病腦組：有急性腦膜炎的臨床表現，血或腦脊液檢測到特異性病毒抗體，或經PCR檢測到病毒DNA，或發病前1周內有明確的病毒感染史，腦脊液其他細菌、寄生蟲、腫瘤檢查均陰性，所有病例經抗病毒治療有效。(3)化腦組：有急性腦膜炎的臨床表現，腦脊液培養中檢測到陽性致病菌，或腦脊液檢測結果符合典型PM的表現，腦脊液其他細菌、寄生蟲、病毒、腫瘤檢查均陰性，所有病例經抗生素治療有效。(4)對照組：有頭痛的臨床表現，但神經系統無陽性體征，腦脊液檢測結果正常。

1．3 方法

1．3．1 取材：用普通干燥管分別收取入組患者的腦脊液2 mL，于4 ℃，RCF(500)×g條件下離心10 min，以去除污染細胞，于-80 ℃冰箱保存備用。

1．3．2 外泌體分離：取保存的結腦組、病腦組、化腦組、對照組的腦脊液，按照ExoQuick Precipitation(美國SBI公司)說明書分離提取CSF中的外泌體。

1．3．3 外泌體的形態學觀察：取分離純化的外泌體10 μL，滴加在2 mm的載樣銅網上，于室溫靜置1 min后用濾紙吸去多余液體，用2%(w/v)磷鎢酸鈉溶液10 μL滴加于載樣銅網上室溫復染5 min后用濾紙吸去多余液體，室溫晾干，于透射電子顯微鏡觀察并照相。

1．3．4 實時定量PCR(qRT-PCR)：按照 miRCURYTMRNA分離試劑盒(Exiqon公司)說明提取各組腦脊液外泌體中的RNA，分光光度法測定RNA含量及濃度。按照miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR system(Exiqon公司)說明書將miRNA逆轉錄為cDNA，其反應的總體積為20 μL。按照GoTaq?qPCR Master Mix熒光定量檢測試劑盒說明書進行熒光定量檢測，以U6為內參，每例樣本重復檢測3次。應用LightCycler 1.5定量PCR儀進行實時定量PCR檢測，計算每個處理組中的每個miRNA 的△Ct值，2-△△Ct表示目的基因miRNA的相對表達量。

2 結果

2．1 外泌體的形態特征 通過透射電鏡觀察，各組均發現外泌體，其大小均一，直徑40 ～ 100 nm，呈圓形或茶托形的小囊泡，外周可見完整的膜性結構，內含低電子密度物質(圖1)。

2．2 let-7d表達水平 實時定量PCR檢測在結腦組、病腦組、化腦組及對照組的let-7d的相對表達量(圖2)；結果顯示，let-7d表達水平結腦組、化腦組與對照組相比均明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)；病腦組與對照組相比也下調，但差異無統計學意義(P>0.05)；化腦組與結腦組相比明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)；結腦組組與病腦組相比明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 電鏡下可見TBM組外泌體直徑40～100 nm，呈圓形或茶托形的膜性小囊泡，其中心為低電子密度成分 圖2 采用qRT-PCR法檢測各組腦脊液外泌體中let-7d的表達水平

3 討論

外泌體作為細胞分泌的囊泡，近年來因其在細胞間的通訊作用受到人們的廣泛關注。這些囊泡通過轉運分子(如miRNA)促進細胞間的通訊，因此可用作指示疾病狀態的生物標志物[7]。外泌體來源的miRNA已被用于癌癥的診斷與預后評估[8]。因此，通過從腦脊液中分離外泌體，并對其內容物進行檢測，具有重要的臨床意義。外泌體的提取方法包括超速離心、免疫磁珠、超濾、沉淀或試劑盒[9]。其中超速離心是最常用的分離方法，但其過程較費時，回收率不穩定，同時受限于儀器設備的配置；近年來，商品化的外泌體提取試劑盒受到廣泛應用，操作簡便，不需特殊的儀器設備，同時可獲得高純度和高回收率的外泌體。本研究采用ExoQuick試劑盒分離提取腦脊液中的外泌體，透射電鏡下觀察到其為大小40 ～100nm，圓形或茶托形具有膜性的小囊泡，與國外文獻報道一致[10]。該方法同時極大縮短了外泌體的提取時間，簡化了操作步驟，因此可廣泛適用于外泌體的臨床研究。

TBM是臨床常見的中樞神經系統感染性疾病，具有病死率高、致殘率高等特點，因此早期診斷及治療能夠顯著改善患者的預后[11]。但傳統的涂片抗酸染色鏡檢法敏感度低，結核分枝桿菌培養法所需時間較長，其當前診斷主要依靠腦脊液常規生化、細胞學檢查，但早期腦脊液檢查結果常難于病毒性腦膜炎、化膿性腦膜炎等感染性疾病相鑒別，極易誤診。隨著科學技術的進展，Wiwanitkit等[12]提出miRNA可能是結核感染中一個有用的生物標志物，可能參與了其感染的發病機制。Yagi等[13]也認為，腦脊液外泌體中miRNA可反映大腦的病理生理過程。本研究發現，在3種腦炎及正常人的腦脊液外泌體中均表達不同水平的let-7d，但與正常人相比化膿性腦膜炎外泌體中let-7d明顯下調，其下調幅度明顯大于TBM及病毒性腦膜炎，而TBM外泌體中let-7d與病毒性腦膜炎相比也明顯下調，因此，我們可通過檢測腦脊液外泌體中的let-7d水平區分這3種腦炎，為臨床診斷提供潛在的生物學標志物。

Let-7d作為let-7家族家族中的一員，存在于let-7a-1/let-7f-1/let-7d集群，位于人類基因組染色體9q22.3的B區[14]；作用于許多靶基因，如MYC、IMP-1、PPARγ受體等[14-16]。MYC是一種多功能、核內磷酸化蛋白，其與Lin28相互作用，共同參與了細胞周期進程、凋亡等過程[14]。同時，let-7家族也是RAS家族的直接和強有力的調控者，let-7d通過抑制K-RAS mRNA的表達引起細胞增殖的減少[17]。近年來，let-7家族被認為在大腦的生長和形態形成中起重要的調節作用[18]，let-7d的表達水平與多能細胞向神經細胞分化中明顯相關[19]。研究認為，miRNA被運輸到外泌體，并使受體基因沉默，推測let-7d可能通過此方式調節結核性腦膜炎相關基因。

本研究表明，在結核性腦膜炎患者腦脊液外泌體中let-7d表達明顯下調，可能為該病的診斷與鑒別提供新的生物學標志物，但let-7d表達水平是否與結核性腦膜炎的發生發展有更深的相關性，仍需進一步深入研究。

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(收稿2016-11-12)

Study of the expression of let-7d from cerebrospinal fluid exosomes in patients with tuberculous meningitis

YinHuimin*，JiaYonglin，LiYanfei，DuanRanran，JingLijun，TengJunfang，JiaYanjie

*DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052，China

Objective To investigate the exosomes isolation from cerebrospinal fluid(CSF) in patients with tuberculous meningitis(TBM) and the expression of let-7d in exosomes．Methods The cerebrospinal fluid from 15 cases with tuberculous meningitis(TBM group)，20 cases with viral meningitis(VM group)，10 cases with purulent meningitis patients(PM group) and 20 normal cases(control group) was collected．ExoQuick Precipitation was used to isolate and purify exosomes and transmission electron microscopy was applied to observe the morphology．Eventually，the expression of let-7d was detected by real-time fluorescence quantitative PCR．Results (1)The exosomes in cerebrospinal fluid were round or cup-shaped，and the diameter was about 40～100nm．Real-time quantitative PCR found varying expression levels of let-7d in exosomes．(2)The expression level of let-7d in TBM group was significantly lower than that in control group(P<0.05)．(3)The TBM and PM groups showed higher down-regulation of the expression level of let-7d compared with the control group(P<0.05)．(4)The expression level of let-7d in the PM group was significantly down-regulated relative to the TBM group(P<0.05)．(5)Significant down-regulation of expression level of let-7d was found in TBM group compared with VM group(P<0.05)．Conclusion Exosomes can be isolated from cerebrospinal fluid in infectious diseases of the central nervous system．By comparing the expression level of let-7d in three sorts of encephslitis，we find that the expression of let-7d in TBM patients is significantly down-regulated，providing a potential biomarker for diagnosis．

Tuberculous meningitis；Exosomes；Isolation；Let-7d

國家自然科學基金(編號：81371385)

R529.3

A

1673-5110(2017)06-0009-04

△通訊作者：賈延劼，E-mail：jiayanjie1971@aliyun.com