祁州漏蘆通過下調JNK和NFκB抑制H2O2致肝細胞凋亡

何鑫+劉春彥+尹基峰+金愛花+尹學哲+全吉淑

[摘要]研究祁州漏蘆對H2O2所致HepG2細胞凋亡的抑制作用機制。建立H2O2誘導的人HepG2細胞損傷模型，采用MTT法檢測細胞存活率；采用化學比色法檢測LDH，ALT，AST活性；采用黃嘌呤氧化酶法檢測細胞SOD活性，二硫代二硝基苯甲酸法檢測GSH含量，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA生成量，比色法測定Caspase3，8，9的相對活性；蛋白印跡法測定Cleaved Caspase3（Casp3），細胞色素c（Cyto c）和NFκB，ERK，JNK，p38 MAPK及其磷酸化蛋白的表達。結果顯示，祁州漏蘆在質量濃度25～400 mg·L-1對HepG2細胞活力無顯著影響。H2O2降低細胞存活率，造成細胞損傷，并上調Casp3，胞漿Cyto c，pJNK以及核NFκB蛋白水平。與模型組比較，祁州漏蘆組細胞存活率升高；培養液中LDH，ALT和AST活性降低；細胞內MDA含量降低，SOD活性和GSH含量升高，Caspase3，8，9相對活性降低，細胞Casp3和胞漿Cyto c蛋白表達降低，細胞pJNK及核NFκB蛋白水平降低。提示，祁州漏蘆對H2O2所致HepG2細胞凋亡具有抑制作用，其作用可能與其抑制JNK激活和NFκB核轉位作用有關。

[關鍵詞]祁州漏蘆；H2O2；氧化應激；凋亡；HepG2

[Abstract]To study the inhibitory effect of Rhaponticum uniflorum on apoptosis induced by H2O2 in HepG2 cells Human HepG2 cells injury models were established by H2O2， then cell survival rate was assayed by MTT method； levels of LDH， ALT， and AST were detected by chemical colorimetric method；SOD activity was detected by xanthine oxidase method； GSH content was detected by dithiobisnitrobenzoic acid（DTNB）； MDA level was detected by thiobarbituric acid （TBA） method；and the relative activities of Caspase3， 8 and 9 were measured by Colorimetry The expression levels of Cleaved Caspase3（Casp3）， cytochrome（Cyto c）， NFκB， ERK， JNK， p38 MAPK， as well as the phospharylated proteins were determined with Western blotting method The results showed that R unifloru had no significant effect on cell viabilities of HepG2 cells at the concentrations of 25400 mg·L-1 However， H2O2decreased the cell viabilities， increased the cellular oxidative stress， and upregulated the protein expressions of Casp3， cytoplasmic Cyto c， pJNK and nuclear NFκB As compared with the model group，R unifloru could increase the cell viability， reduce LDH， ALT and AST leakage， reduce the MDA formation， increase the SOD and GSH levels，reduce the relative activities of Caspase3， 8 and 9， downregulated the protein expressions of Casp3 and cytoplasmic Cyto c， and downregulate the pJNK and nuclear NFκB levelsThe results indicated that R unifloru had the inhibitory effect on apoptosis induced by H2O2in HepG2 cells， and the mechanism maybe associated with inhibiting JNK activation and NFκB nuclear translocation

[Key words]Rhaponticum unifloru； H2O2； oxidative stress； apoptosis； HepG2

近年來肝病發生率的逐年上升已經引起社會的關注，而活性氧引發的肝細胞氧化應激是多種肝病發生的重要機制之一，因此，探討如何有效緩解氧化應激損傷對肝病的防治具有重要意義[1]。祁州漏蘆是菊科植物Rhaponticum uniflorum （L） DC的干燥根，是一味常用中藥。廣泛分布于我國內蒙古、東北、山東等地區，藥源豐富。它性味咸、苦、寒，能清熱解毒，消腫排毒，通乳汁；主治于乳汁不通、淋巴結結核、風濕性關節炎、痔瘡等[23]。近年來研究發現，祁州漏蘆具有提高機體免疫、抗動脈硬化、抗脂質過氧化、抗衰老、抗炎等作用[46]。課題組研究還發現，祁州漏蘆具有良好的保肝作用，能預防多種因素引起的肝損傷，如，可抑制四氯化碳、氨基半乳糖所致化學性肝損傷以及對乙酰氨基酚所致藥物性肝損傷等[79]。本實驗通過建立H2O2致HepG2細胞損傷模型，預防性給藥后觀察祁州漏蘆水提物對氧化損傷所致凋亡以及凋亡相關蛋白表達的變化，以便探討祁州漏蘆肝細胞損傷的保護作用機制，為祁州漏蘆的保肝作用研究提供參考。

1材料

11藥物與試劑將祁州漏蘆切碎后加水煎煮，濾液經減壓蒸餾即得祁州漏蘆提取物（RU）干品，主要成分為多糖（81%）和甾酮（12%）[6]；用無血清培養液配成所需濃度，過濾除雜除菌備用。人HepG2肝癌細胞購自南京凱基生物有限公司。DMEM培養基、胎牛血清購自Gibco公司；MTT購自SigmaAldrich公司； LDH，ALT，AST，MDA，GSH，SOD試劑盒購自南京建成科技有限公司；Caspase3，8，9檢測試劑盒、線粒體/細胞核制備試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；兔NFκB p65多克隆抗體、兔pNFκB p65多克隆抗體、小鼠ERK多克隆抗體、兔pERK多克隆抗體、兔JNK多克隆抗體、兔pJNK多克隆抗體、兔p38多克隆抗體、兔pp38 MAPK多克隆抗體購自Abcam公司；兔Cleaved Caspase3（Casp3）單克隆抗體、兔細胞色素c（Cyto c）單克隆抗體購自Cell Signaling公司。

12儀器二氧化碳培養箱（美國Shellab公司）；臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；酶標儀（深圳雷杜公司）；垂直版電泳儀及轉印槽（美國BioRad公司）；凝膠成像分析儀（美國UVP公司）。

2方法

21細胞培養及傳代細胞培養和傳代按常規方法進行，含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，37 ℃，5%CO2的飽和濕度培養箱中培養，取對數生長期細胞用025%胰蛋白酶溶液消化進行傳代[10]。

22RU試驗劑量的確定細胞接種于96孔板中培養12 h后，正常組換成無血清培養液；其余6組為藥物組，加RU溶液使其質量濃度分別為25，50，100，200，400，800 mg·L-1。繼續培養24 h，吸出培養液，加入MTT溶液，MTT法檢測細胞存活率。另設空白孔（只加RU溶液）以排除藥物干擾[10]。以細胞存活率（100±5）%為標準確定RU安全濃度[1011]。細胞存活率=（實驗組-空白組）/（正常組-空白組）×100%。

23細胞損傷模型的建立和細胞存活率的檢測細胞接種于96孔板，培養12 h細胞全部貼壁后，分為正常組、模型組及RU高、中、低劑量組（分別為RU 200，RU 100和RU 50組，質量濃度分別為200，100，50 mg·L-1）。RU組加入相應的含藥培養液，孵育24 h；正常組和模型組加入無血清培養液繼續孵育24 h；除正常組外，其余組加入300 μmol·L-1 H2O2造模[12]。MTT法檢測細胞存活率。

24細胞培養液中LDH，ALT，AST釋放的檢測細胞分組、造模和給藥按23項方法。按試劑盒說明書檢測培養液中LDH，ALT，AST的活性。

25細胞MDA，GSH生成和SOD活性的檢測按23項方法將細胞在6孔板中分組、造模和給藥。細胞用025%的胰酶消化，收集細胞并裂解，離心取上清。按照試劑盒說明書檢測細胞MDA，GSH水平和SOD活性。

26細胞Caspase3，8，9的相對活性的測定裂解細胞，離心取上清，并按照試劑盒說明書測定細胞Caspase3，8，9的相對活性。

27細胞Casp3，Cyto c，NFκB，ERK，JNK，p38蛋白及其磷酸化蛋白水平的檢測收集和裂解細胞，并提取細胞總蛋白。每組以20 μg蛋白進行SDSPAGE電泳分離，轉移至PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉，加一抗孵育過夜，加HRP標記二抗孵育1 h，加ECL試劑顯色，采集圖像并進行灰度比值分析[67]。

28統計學處理數據以±s表示，采用SPSS 190統計軟件，采用單因素方差分析及t檢驗進行數據處理。

3結果

31RU對HepG2細胞生長的影響隨著RU濃度的升高，細胞存活率呈升高趨勢；質量濃度介于50～400 mg·L-1時，HepG2細胞存活率為100%～105%，對細胞生長無顯著影響；當質量濃度為800 mg·L-1時，細胞存活率為107%，與正常組比較差異顯著（P<005），有促細胞生長作用，見圖1。因此，本研究選50，100，200 mg·L-1為RU干預劑量進行后續研究。

32RU對細胞存活率以及LDH，ALT，AST釋放的影響正常組的HepG2細胞生長良好，培養液中3種酶活性不高，說明正常組細胞沒有受到損傷；H2O2損傷后HepG2細胞存活率僅為正常組的54%，與正常組比較顯著降低（P<005）；細胞培養液中LDH，ALT，AST活性分別增高372%，226%，219%，與正常組比較顯著升高（P<005）。與模型組比較，RU各組細胞存活率顯著增高（P<005），培養液中LDH，ALT，AST活性顯著降低（P<005）。表明，RU干預降低H2O2所致細胞損傷，見表1。

33RU對細胞MDA，GSH水平和SOD活性的影響與正常組比較，模型組細胞SOD活性和GSH含量顯著降低（P<005），MDA含量顯著升高（P<005）。與模型組比較，RU各組細胞SOD活性與GSH含量顯著升高（P<005），MDA含量降低（P<005），表明RU干預使細胞抗氧化能力增高，氧化應激降低，見表2。

34RU對Caspase3，8，9相對活性的影響與正常組比較，模型組細胞Caspase3，8，9的相對活性顯著增高（P<005）；與模型組比較，RU各組細胞Caspase3，8，9的相對活性顯著降低（P<005），表明RU抑制H2O2所致肝細胞凋亡，見表3。

35RU對細胞Casp3 p17和胞漿Cyto c蛋白水平的影響蛋白印跡結果顯示，與正常組比較，模型組細胞Casp3 p17和胞漿Cyto c蛋白水平顯著增高何鑫等：祁州漏蘆通過下調JNK和NFκB抑制H2O2致肝細胞凋亡

36RU對細胞MAPK磷酸化的影響H2O2不影響3種MAPK總蛋白水平，對p38磷酸化水平也無顯著影響，但上調ERK和JNK磷酸化水平（P<005）。與模型組比較，RU組細胞JNK磷酸化水平顯著降低（P<005），但ERK磷酸化水平無顯著變化，見圖3。

37RU對細胞NFκB磷酸化和核轉位的影響

4討論

在肝損傷發生發展過程中，氧化應激是重要環節。因此，尋找對抗肝臟氧化應激的藥物，可作為治療肝損傷關鍵途徑之一[11]。祁州漏蘆為傳統中藥，其保肝作用研究已有一定積累[79]。本試驗以人HepG2肝癌細胞構建H2O2誘導的氧化應激損傷模型，研究祁州漏蘆的抗肝細胞損傷作用，為闡明祁州漏蘆保肝機制提供參考。

當肝細胞受到H2O2誘導的氧化應激損傷時，細胞存活率和細胞毒性是反映細胞受損程度的重要指標。而LDH，ALT，AST作為肝細胞穩定的胞內酶，培養液中其活性升高是檢測肝細胞毒性的重要指標之一[1113]。本實驗結果顯示，祁州漏蘆干預可降低細胞毒性，提高細胞存活率，對H2O2誘導的肝細胞損傷具有保護作用。

在H2O2誘導的細胞損傷中，氧化應激是重要損傷機制。肝細胞受損后產生的過量活性氧自由基，攻擊生物膜，引發脂質過氧化，使過氧化物水平增高，因此MDA可以反映組織細胞受自由基攻擊的嚴重程度[1113]。本實驗結果表明，祁州漏蘆干預可升高細胞SOD活性和GSH含量；降低細胞MDA生成，提示，祁州漏蘆可通過減輕H2O2誘導的肝細胞氧化應激而達到抑制肝細胞損傷。

氧化應激損傷同樣會誘導肝細胞發生凋亡。氧化應激損傷中產生的過量活性氧會損傷功肝細胞線粒體，使其釋放Cyto c，繼而活化Caspase家族，并最終導致細胞凋亡[14]。Caspase級聯反應是推動細胞凋亡程序的核心事件，其中Caspase9為內源性的線粒體凋亡途徑的關鍵酶，Caspase8為外源性的死亡受體途徑的關鍵酶，二者分別在細胞凋亡的2條主要途徑中起作用，而Caspase3則為凋亡的執行者，是2條凋亡通路的共同環節，因此是凋亡發生的標志酶[1314]。本研究顯示，H2O2上調Casp3和胞漿Cyto c蛋白表達，增高肝細胞Caspase3，8，9相對活性，而祁州漏蘆干預可下調Casp3和胞漿Cyto c蛋白表達，降低肝細胞Caspase3，8，9相對活性。提示，祁州漏蘆抑制H2O2誘導的肝細胞凋亡，至少與Cyto c釋放引起的線粒體途徑相關，死亡受體途徑的參與還需進一步探討。

氧化應激還可通過多個通路增強MAPK磷酸化而導致細胞凋亡或壞死基因的激活或改變[15]。MAPK通路是細胞外信號到細胞內的主要信號通路，ERK普遍認為是“細胞生存”通路，JNK通路則形成調控細胞增殖和凋亡的一個復雜網絡，存在協同和拮抗的現象，p38調控炎癥反應，調節NFκB活化[16]。NFκB是一種具有多向轉錄調節作用的蛋白因子，其與肝細胞損傷的關系一直是肝臟疾病研究中的熱點[17]。研究證實，活性氧可以直接激活NFκB轉移入細胞核，誘導靶基因的轉錄，促進各種炎癥介質釋放而導致肝細胞炎癥，誘發肝細胞凋亡[17]。本研究結果顯示，H2O2上調ERK，JNK和NFκB磷酸化以及NFκB核轉位水平，而祁州漏蘆干預可下調JNK磷酸化和NFκB核轉位水平，對ERK和NFκB磷酸化水平無顯著影響。提示，祁州漏蘆可能是通過抗JNK激活和NFκB核轉位作用而抑制肝細胞凋亡的。祁州漏蘆抗細胞凋亡作用中NFκB和JNK之間的關聯、以及線粒體凋亡通路之間的關系需進一步研究。

綜上所述，祁州漏蘆對H2O2所致HepG2細胞凋亡具有抑制作用，其作用可能與其抗JNK激活和NFκB核轉位作用有關。

[參考文獻]

[1]韓延忠，周永峰，桑秀秀，等 氧化苦參堿對H2O2誘導L02細胞損傷的抑制作用及其機制的研究[J] 中國中藥雜志，2016， 41（7）：1302

[2]全國中草藥匯編編寫組 全國中草藥匯編. 下冊[M] 2版.北京：人民衛生出版社，1996：919

[3]金愛花 漏蘆對小鼠H22肝癌皮下移植瘤的抑制作用及機制研究[D] 延吉：延邊大學，2011

[4]鄒莉波，于慶海，蔡虹 祁州漏蘆抗氧化作用的實驗研究[J]. 沈陽藥學院學報，1992， 9（1）： 73

[5]張學武，李天洙，孫權 漏蘆提取物抗炎、鎮痛、耐缺氧及抗疲勞作用的研究[J] 四川中醫，2005， 23（7）： 45

[6]李勇，金明，全吉淑 漏蘆水提取物抗脂質過氧化活性分析[J] 中國公共衛生，2011， 27（10）： 1338

[7]宋昊，趙文璽，王玉嬌，等 祁州漏蘆對四氯化碳所致肝臟氧化應激和DNA損傷的影響[J] 中國藥學雜志，2013， 48（22）：1915

[8]宋昊，朱璟，金梅花，等 祁州漏蘆不同溶劑提取物對急性肝損傷模型小鼠的保護作用[J] 中國藥房，2014， 25（3）：205

[9]金明，高峰，金梅花，等 祁州漏蘆對D氨基半乳糖所致小鼠急性肝損傷的保護作用[J] 食品研究與開發，2016， 37（2）：1

[10]劉春彥 漏蘆對H2O2誘導的HepG2細胞損傷的保護作用[D] 延吉：延邊大學，2012

[11]韓林，李健，林欣，等 黃芪甲苷對Chang Liver細胞酒精性和非酒精性氧化損傷的保護作用[J] 中國中藥雜志，2014， 39（22）：4430

[12]金明，王玉嬌，金梅花，等 兩種細胞建立肝細胞氧化損傷模型比較[J] 中國公共衛生，2015， 31（3）：324

[13]賀蘭芝，孟雅坤，韓延忠，等 木犀草素對對乙酰氨基酚誘導的L02肝細胞損傷的保護作用[J] 中國中藥雜志，2016， 41（22）：4234

[14]董曦，孫桂波，羅云，等 異鼠李素對H2O2引起的H9C2細胞氧化應激損傷的保護作用研究[J] 中國藥理學通報，2015， 31（6）：853

[15]吳娜，蔡光明，何群 氧化應激與肝臟損傷[J] 世界華人消化雜志，2008， 16（29）：3310

[16]尹學哲，王玉嬌，尹基峰，等 草蓯蓉提取物對HepG2細胞氧化應激損傷的保護作用[J] 食品科學，2015， 36（15）：173

[17]尹學哲，王玉嬌，尹基峰，等 草蓯蓉多糖對過氧化氫損傷HepG2細胞NFκB表達的影響[J] 中國老年學雜志，2016， 36（13）：3108[責任編輯張寧寧]