延齡草與吉林延齡草根莖及須根中3種皂苷成分的含量測定

楊印軍+孫欣光+楊杰+李齊+張潔+趙陽+馬百平+郭寶林

[摘要]比較延齡草與吉林延齡草藥材根莖與須根間主要成分的含量差異，利用HPLCCAD同時測定了3種主要成分重樓皂苷Ⅶ、偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ的含量。色譜條件：TSK gel ODS（46 mm×250 mm， 5 μm）色譜柱，乙腈水（43∶57）等度洗脫，流速為1 mL·min-1，進樣量為20 μL。電霧式檢測器（CAD）：工作氣壓為35 psi（1 psi=6895 kPa），霧化器溫度為35 ℃。3種甾體皂苷良好分離，線性關(guān)系、穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、加樣回收試驗均符合中藥質(zhì)量分析要求。運用IBM SPSS Statistics 20分析軟件進行主成分分析，結(jié)果顯示，頭頂一顆珠的來源包含了2種延齡草屬植物，且吉林延齡草為主要資源；7批延齡草樣品和9批吉林延齡草的根莖之間3種皂苷成分的含量存在不顯著差異；但是根莖與須根之間3種皂苷成分的含量存在顯著的差異。

[關(guān)鍵詞]HPLCCAD； 延齡草與吉林延齡草； 根莖與須根； 甾體皂苷； 含量測定； 主成分分析

[Abstract]To compare the differences of main components between in rhizoma and fibrous root of Trillium tschonoskii and T kamtschaticum， a simple， accurate and reliable high performance liquid chromatography coupled with the charged aerosol detector （HPLCCAD） method was developed and then successfully applied for simultaneous quantitative analysis of three compounds， including polyphyllin Ⅶ （T1），pennogenin 3OαLrhamnopyranosyl（1→2） [αLrhamnopyranosyl（1→4）]βDglucopyranoside （T2），polyphyllin Ⅵ （T3）， in 16 batches of rhizome and 14 batches of fibrous root The analytes were well separated from other constituents on TSK gel ODS （46 mm×250 mm， 5 μm） with acetonitrilewater （43∶57） at a flow rate of 10 mL·min-1 The injection volume was 20 μL The nitrogen inlet pressure for the CAD system was 35 psi and the nebulizer chamber temperature was 35 ℃The method was validated for linearity （r>0999 0）， intra and interday precision （029%30%）， repeatability （045%14%）， stability （19%26%）， recovery （1001%1002%， 12%18%）， limits of detection （0002 g·L-1）， and limits of quantification （0005 g·L-1）The obtained datasets were processed by principal component analysis （PCA） and it showed that there was almost no difference in rhizoma of T tschonoskii and T kamtschaticum from different areas of China However， the 3 major compounds existed in rhizoma were different from those in fibrous root of T tschonoskii and T kamtschaticum

[Key words]HPLCCAD； Trillium tschonoskii and Trillium kamtschaticum； rhizoma and fibrous root； steroid saponin； determination； principal component analysis （PCA）

延齡草為百合科延齡草屬植物，全世界共有約50種，我國有3種，即延齡草Trillium tschonoskii Maxim、吉林延齡草T kamtschaticum Pall，分布于吉林、西藏延齡草T govanianum Wall（僅見于西藏卡馬河下游）[1]。其中，延齡草T tschonoskii被《湖北省中藥材標準》收錄，藥材名頭頂一顆珠，又名芋兒七、佛手七、獅兒七等，藥用部位為根及根莖。其味甘、性平、有小毒，有延年益壽的功效，主治頭暈?zāi)垦！⒌驌p傷、神經(jīng)衰弱、高血壓病和腦震蕩后遺癥等疾病，為土家族常用藥材[23]。本課題組在進行頭頂一顆珠的產(chǎn)地和市場資源調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，目前河北安國、安徽亳州、四川成都和廣西玉林等藥材市場流通的頭頂一顆珠藥材均為來自吉林的吉林延齡草，安徽亳州市場的藥材也以黑龍江產(chǎn)為主，中藥材天地網(wǎng)誠實通平臺銷售的頭頂一顆珠也是吉林延齡草，表明頭頂一顆珠藥材的來源值得研究。

延齡草中主要的化學(xué)成分為甾體皂苷，黃酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷等[4]，目前已有延齡草藥材中總皂苷及主要甾體皂苷成分含量測定的研究報道[56]，但迄今為止尚未有吉林延齡草的質(zhì)量研究和相關(guān)報道。本研究利用HPLCCAD測定2種延齡草藥用部位（根狀莖和須根）中重樓皂苷Ⅶ、偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ等3種主要皂苷的含量，其中重樓皂苷Ⅶ和重樓皂苷Ⅵ也是重樓中的重要活性成分[78]。同時，利用統(tǒng)計學(xué)方法分析幾個重要產(chǎn)區(qū)的延齡草與吉林延齡草之間及根莖與須根之間化學(xué)成分的差異，為延齡草屬藥材合理利用及質(zhì)量評價提供了科學(xué)依據(jù)。

1材料

11實驗樣品

藥材來源信息見表1，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草T tschonoskii和吉林延齡草T kamtschaticum，對1份樣品中同時有根狀莖和須根的，分開2個部位測定。

12藥品及試劑

對照品重樓皂苷Ⅶ（T1），偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖（T2）、重樓皂苷Ⅵ（T3）均為本課題組從延齡草中分離得到，HPLC面積歸一化法測得純度均≥98%。

乙腈（色譜純）購于美國Fisher公司；蒸餾水購于廣州屈臣氏有限公司。

13主要儀器

Waters 2695分析型高效液相色譜（Empower工作站），配置有Waters 2487 DAD檢測器，ELSD檢測器（2000ES，Alltech，USA），CAD檢測器（Corona Ultra，Thermo Fisher，USA）；TP 600超聲波清洗機（天鵬電子新技術(shù)有限公司）；BP 211D 1/10萬天平（德國Sartorius公司）。

2方法與結(jié)果

21對照品溶液制備

分別精密稱取3種對照品各1250 mg于5 mL量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，即得250 g·L-1的各對照品儲備液，并按照T1T2T3（1∶2∶2）配制成含T1，T2，T3分別為05，100，100 g·L-1的混合對照品儲備液。

22供試品溶液制備

精確稱取干燥藥材粉末（過40目篩）05 g于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇溶液，稱重，浸泡30 min，常溫下超聲提取（功率500 W，頻率40 kHz）40 min，放冷，用80%甲醇溶液補足失重，搖勻，022 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

23色譜條件

色譜柱TOSOH TSKgel ODS100V （46 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈水（43∶57），等度洗脫15 min；流速10 mL·min-1；電霧式檢測器（CAD）工作氣壓35 psi（1 psi=6895 kPa）、霧化器溫度35 ℃；進樣量20 μL。色譜圖如下圖1。

24方法學(xué)考察

241線性關(guān)系精密吸取各混合對照品儲備液25，50，100，250，500，750，1 000 μL分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得各系列濃度的混合標準品溶液。按照23項下條件進樣20 μL測定，以峰面積（Y）對對照品濃度（X，mg·L-1）進行線性回歸，得各對照品回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。以信噪比S/N=3為基準，測得最低檢測限，以信噪比S/N=10為基準，測得最小定量限，結(jié)果見表2。

242精密度試驗精密吸取對照品溶液按23項下色譜條件，于同1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，對照品重樓皂苷Ⅶ，偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ的日內(nèi)峰面積 RSD分別為062%，041%，029%；連續(xù)3 d內(nèi)每天連續(xù)進樣6次，測得日間峰面積RSD分別為30%，18%，21%，表明儀器精密度良好。

243重復(fù)性試驗取樣品粉末（JR1）6份，分別按22項下方法制備供試品溶液，按23項下色譜方法測定，計算樣品中重樓皂苷Ⅶ，偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ含量的RSD分別為14%，045%，058%，結(jié)果表明實驗重復(fù)性良好。

244穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液（JR1），分別于0，2，4，8，12，24 h進樣測定。計算重樓皂苷Ⅶ，偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ峰面積的RSD分別為26%，19%，19%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

245加樣回收率試驗取已知含量的供試品粉末（JR1）9份，每份各約 025 g，精密稱定，分別置于50 mL離心管中，精密加入含T1，T2，T3分別為15，55，62 g·L-1的混合標準溶液800，1 000，1 200 μL，按照21項下方法平行制備，23項下色譜方法測定，測得T1，T2，T3的平均回收率見表3，結(jié)果表明該方法的準確性良好。

25樣品的含量測定

樣品測定結(jié)果見表4。結(jié)果顯示延齡草及吉林延齡草根莖中重樓皂苷Ⅶ、偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ的量為451～1357，1228～3347，1452～4006 mg·g-1；延齡草及吉林延齡草須根中重樓皂苷Ⅶ的量為587～1825 mg·g-1，而偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖和重樓皂苷Ⅵ在本實驗條件下僅可在部分須根樣品檢測到。

26結(jié)果分析

以延齡草及吉林延齡草根莖中3種甾體皂苷的含量為基礎(chǔ)，采用IBM SPSS Statistics 20分析軟件進行主成分分析，制成散點圖，見圖2。同樣地，以延齡草及吉林延齡草根莖和須根中3種甾體皂苷的含量為基礎(chǔ)，采用該分析軟件進行主成分分析，結(jié)果見圖3。圖2中不同產(chǎn)地延齡草及吉林延齡草根莖各樣本互相混雜分布，說明二者之間無明顯差異。其中陜西產(chǎn)一份延齡草樣品（YR5）未檢測到重樓皂苷Ⅵ，而黑龍江產(chǎn)吉林延齡草（JR4）中重樓皂苷Ⅵ含量非常高，從而與其余樣品差異較明顯。圖3結(jié)果可見，根莖樣本與須根樣本可以基本分為2類，

不同部位之間差異比較顯著。

3討論

31樣品提取條件的優(yōu)化

樣品提取過程中考察了超聲提取法和加熱回流提取法，通過比較3種待測成分的峰面積發(fā)現(xiàn)，二者提取效果相當(dāng)，故選擇操作簡便、快速的超聲提取法。超聲提取法中，分別考察了提取溶劑（60%甲醇、80%甲醇、無水甲醇、60%乙醇、80%乙醇、無水乙醇）、提取物料比（1∶25，1∶50，1∶75，1∶100）、提取時間（20，40，60 min）對待測成分提取率的影響。最終優(yōu)化的提取條件為80%甲醇作提取溶劑，提取物料比為1∶100，超聲提取40 min。

32檢測器的選擇

甾體皂苷一般用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）

作為通用型檢測器，但其靈敏度較低。電霧式檢測器（CAD）同樣作為通用型檢測器，且具有較高的靈敏度正得到廣泛使用[910]。文獻報道[6，11]，待測3種甾體皂苷在203 nm下有紫外吸收，本實驗考察了DAD，ELSD及CAD 3種檢測器的靈敏度，檢測限依次為032，021，004 μg，定量下限依次為056，038，010 μg。所以，本文選擇了靈敏度高的CAD檢測器。

33延齡草和吉林延齡草藥材比較

延齡草和吉林延齡草植物形態(tài)區(qū)別明顯，但藥用部位為根莖和須根的頭頂一顆珠藥材難以從形態(tài)上區(qū)分和確定來源物種，《中華本草》記錄的頭頂一顆珠也是來源于這2個物種，藥材形態(tài)也未加區(qū)分[12]。《中國植物志》記載延齡草T tschonoskii分布于云南、四川、湖北、安徽，陜西的秦嶺以南，吉林延齡草T kamtschaticum分布于吉林，地理分布上是完全不同的。為了進一步找到區(qū)別二者的方法，本研究組嘗試了DNA條形碼鑒定方法，依據(jù)ITS2序列無法區(qū)分二者。因此本文從來源分布上初步認定延齡草和吉林延齡草樣品（部分來自于市場的樣品則與銷售商認真溝通確認了來源的產(chǎn)地）。本文實際的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于延齡草分布局限于1 600 m以上的高海拔地區(qū)，在湖北和重慶更是要2 000 m以上才生長，資源量很稀少，而吉林延齡草資源較多，所以頭頂一顆珠可能一直是以吉林延齡草為主流的。從本文測定的16份樣品中3種主要皂苷成分的含量上看，二者沒有差別，建議湖北省藥材標準修訂時增加來源物種為2個種。

34延齡草根莖和須根的成分含量比較

2種延齡草的根莖與須根的比較結(jié)果顯示，二者存在較大差異。在15批（除YR5）根莖樣品中，所測3種成分均存在，其中偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖、重樓皂苷Ⅵ的含量均比重樓皂苷Ⅶ高，分別是重樓皂苷Ⅶ含量的226～412倍、289～480倍。但在14批須根樣品中均未檢測到重樓皂苷Ⅵ，僅有5批樣品同時檢測到重樓皂苷Ⅶ和偏諾皂苷元3βOαL吡喃鼠李糖基（1→4）[αL吡喃鼠李糖基（1→2）]OβD葡萄糖。并且14批須根樣品中，重樓皂苷Ⅶ的含量均最高，其中11批高于同批次根莖中的含量，是根莖中的含量145～253倍。同時發(fā)現(xiàn)重樓相關(guān)研究中也有報道，重樓須根中重樓皂苷Ⅶ的含量明顯高于根莖中的含量[13]。湖北省藥材標準中規(guī)定的藥材來自于根和根莖，但是本文收集的樣品中有2份是僅有根莖而無須根的，因2個部位的成分構(gòu)成上存在差異，建議應(yīng)有所區(qū)別。

[參考文獻]

[1]汪發(fā)纘， 唐進. 中國植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社， 1980.

[2]葛月賓，萬定榮. 《湖北省中藥材質(zhì)量標準》擬收載部分土家族藥材的成分和藥理研究進展[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2008（4）：50.

[3]楊福生，劉勝祥，雷耘. 神農(nóng)架自然保護區(qū)百合科植物區(qū)系及資源植物分析[J]. 黃岡師專學(xué)報，1998（4）：26.

[4]喻玲玲，鄒坤. 延齡草屬植物的化學(xué)成分及藥理活性研究進展[J]. 中成藥， 2008，30 （9）：1350.

[5]崔瑾瑾. 延齡草藥材質(zhì)量標準及化學(xué)成分的研究[D]. 武漢：湖北中醫(yī)學(xué)院，2009.

[6]王彥彥，張忠立，左月明，等. 不同產(chǎn)地及不同藥用部位延齡草中3種皂苷的含量測定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（9）：3850.

[7]中國藥典. 一部[S]. 2015.

[8]Man S， Gao W， Zhang Y， et al. Qualitative and quantitative determination of major saponins in Paris and Trillium by HPLCELSD and HPLCMS/MS[J]. J Chromatogr B， 2010， 878（29）： 2943.

[9]劉路，高旋，楊永健. HPLC電霧式檢測器的應(yīng)用[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2012（3）：227.

[10]Zhang C， Sun X， Zhao Y， et al. Quantitative analysis of toosendanin in the fruit of Melia toosendan Sieb. Et Zucc （Meliaceae） by highperformance liquid chromatography coupled with charged aerosol detection[J]. Chromatographia， 2016， 79（19/20）： 1381.

[11]吳華強，張忠立，左月明，等. HPLC法同時測定延齡草根及根莖中延齡草皂苷B2、B1、B3的含量[J]. 江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013（3）：46.

[12]國家中醫(yī)藥管理局，中華本草編委會. 中華本草. 第8冊[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

[13]葉方，胡培，楊光義，等. 重樓根莖與須根中四種重樓皂苷含量比較[J]. 中國醫(yī)藥，2015，18（12）：2073.[責(zé)任編輯丁廣治]