地黃植株體內miRNAs與其連作障礙關系的研究進展

曹曉風+楊艷會+馮法節+李明杰+古力+王豐青+陳新建+張重義

[摘要]MicroRNAs是一類內源性小分子的非編碼RNA，它通過對其靶基因的降解或抑制翻譯來調控基因表達，進而調控植物的生理活動。植物在遇到逆境脅迫時，miRNAs會作用于與逆境相關的基因，啟動體內的抗逆機制抵抗不利因素。地黃的連作障礙也是一種脅迫，從miRNAs水平上研究，有利于解讀地黃連作障礙的分子機制。該文對地黃體內miRNAs的功能及調控機制進行了綜述，并對miRNAs在地黃的研究中進行了展望。

[關鍵詞]地黃； miRNAs； 連作障礙； 脅迫； 基因調控

[Abstract]The efficacy of Rehmannia glutinosa which as a large quantity of traditional Chinese medicine is significant. However， the land must be given up after one season of R. glutinosa cultivation or replanted after a period of 810 years because of the severe continuous cropping obstacles. MicroRNAs is a class of endogenous noncoding small RNAs， which participate in regulation of physiological activities by target mRNA cleavage or translational repression in plants. In recent years，studies on the role of miRNAs in plants have made significant progresses，especially in medicinal plants.MiRNAs from some different medicinal plant species have been identified with regulatory effects.When plants are exposed to environmental stress， miRNAs act on stressrelated genes and initiate stressresistance mechanisms in the body against adverse factors. R. glutinosa is also a kind of environmental stress. It is conducive to deciphering the molecular mechanism of continuous cropping obstacles for us by researching miRNAs. This article reviews the production of miRNAs， mechanism， research approaches and characteristics of resisting the environmental stresses in plants， the development trends and future prospect of R. glutinosa miRNAs research.

[Key words]Rehmannia glutinosa； microRNA； continuous cropping obstacles； stress； gene regulation

MicroRNAs（miRNAs）作為真核生物細胞內基因表達的重要調控因子，越來越備受關注[1]。miRNAs是一類內源的、長度約 21～24 nt的非編碼小RNA（Small RNA）分子，它最早在線蟲Caenorhabditis elegans L中被發現，之后在擬南芥、玉米、小麥、水稻等植物中，通過高通量測序、生物信息學預測、基因克隆等方法鑒定了不同類型和不同數量的miRNAs家族[2]。隨著miRNAs研究的不斷深入，通過對擬南芥、水稻等模式植物miRNAs 功能的研究揭示了miRNAs 在植物的生長、發育、逆境脅迫等生理過程中發揮著重要作用[3]。最近的研究表明：植物在不同的逆境脅迫下誘導特異miRNAs 的表達，并證實了某些miRNAs 在植物遭受逆境脅迫時而做出適應性調整的過程中起著重要的調控作用[4]。

地黃Rehmannia glutinosa L屬玄參科多年生草本植物，以塊根入藥，是我國著名的“四大懷藥”之一。但在地黃種植過程中，連作障礙已成為制約地黃規模化生產的重要因素之一。重茬地黃表現為植株生長不良、地下部多形成須根，塊根不能正常膨大，產量和品質明顯下降，甚至絕收。大量的研究正在試圖解密連作障礙形成的生物學機制[56]。地黃的連作障礙其實是一種逆境脅迫現象，隨著地黃連作障礙分子機制研究的深入，從miRNAs的調控機制入手，揭示連作障礙的形成過程，已取得初步進展，其結果表明：重茬地黃體內存在著特異的miRNAs響應，即miRNAs參與了地黃連作障礙的分子調控[79]。本文對前期報道的地黃體內miRNAs的發掘及其功能解析、miRNAs在地黃連作障礙形成中的調控機制等方面進行綜述，為深化地黃連作障礙形成的分子機制研究提供參考。

1地黃體內miRNAs的發掘及其功能解析

11植物miRNAs的形成機制植物miRNAs 是由分布于整個基因組中獨立的 MIR 基因編碼產生的，MIR基因由 RNA聚合酶 Ⅱ（PolⅡ）轉錄產生一個或多個較長的初級轉錄產物（PrimiRNAs）；PrimiRNAs結構由miRNAs，miRNAs互補片段和中間間隔區組成，長度為60～300 nt，進一步形成一個特定的二級莖環的發夾結構；具發夾結構的PrimiRNAs被DCL1（Dicerlike 1）切割為前體 miRNAs（PremiRNAs），形成雙鏈 miRNAs（miRNAs：miRNAs）復合物；再在HYL1 （Hyponastic leaves 1）、HEN1（Hua enhancer 1）、HST（Hasty）等蛋白的協助下從細胞核轉運到細胞質中，解旋后與AGO（Argonaute）蛋白作用形成一個RNA誘導沉默復合物（RNAinduced silencing complex，RISC），產生的單鏈成熟miRNAs保留在RISC復合體中，并結合到與其互補的靶mRNA位點，在轉錄后水平上介導靶mRNA的降解或翻譯抑制來實現基因表達的負向調控[1011]。

12地黃miRNAs的鑒定根據miRNAs產生的特點，miRNAs的鑒定首先是通過對細胞sRNA直接克隆并測序而獲得的。之后，利用生物信息學方法（包括比較基因組預測、同源搜索、利用前體物序列的二級結構特征分析等）預測了許多物種基因組、轉錄組或EST序列數據庫中存在的miRNAs[1214]。近年來，利用高通量測序技術已從65種植物中鑒定了7 827個miRNAs家族（miRBase 210 數據庫）。2011年，Yang等[7，9]利用高通量測序技術構建了頭茬和重茬地黃sRNAs文庫，利用生物信息學技術首次從地黃中鑒定了25個保守的miRNAs家族。根據miRNAs前體物二級結構特征，以NCBI數據庫中僅有的1 536條地黃EST序列作為參考序列，利用RNAfold軟件和RTPCR方法，從地黃中克隆并鑒定了6個新型miRNAs （屬于6個miRNAs家族）。miRNAs在生物體內廣泛存在，其數量約為編碼基因總量的1%[15]。前期研究以EST數據庫為參考所鑒定的地黃miRNAs種類和數量非常有限，為進一步發掘地黃體內的miRNAs，Yang等[7，9]和Li等[8]先后重新構建了不同年份的頭茬和重茬地黃sRNAs文庫，利用生物信息學技術共鑒定598個保守的miRNAs家族。基于地黃轉錄組數據庫，利用生物信息學和克隆技術鑒定新型的miRNAs。地黃體內miRNAs的鑒定為探索地黃連作障礙的分子調控機制提供了重要的基礎數據。

13地黃miRNAs靶基因預測、鑒定及其功能由于植物miRNAs 與其剪切的靶基因位點幾乎完全互補配對，根據這一特征可準確預測miRNAs潛在的靶基因。前期許多研究利用植物psRNATarget，miRU，Targetfind，Targetalign 等預測miRNAs的靶基因被發現并得以證實[1617]。在地黃功能研究中，Yang等[7]首先利用psRNATarget軟件對29個miRNAs靶基因進行預測，獲得了372個靶基因，其功能分析表明，它們可能具有轉錄因子、金屬離子結合、核甘酸結合、蛋白修飾等分子功能，參與了轉錄調控、新陳代謝、逆境生理等多種的生理活動過程。伴隨高通量測序的發展，German等[1819]首次運用降解組測序技術（degradome sequencing）檢測了miRNA剪切的靶基因，該方法結合了高通量測序技術、生物信息學分析和RACE驗證三者優勢，已成功應用于許多植物miRNAs靶基因的鑒定。2013年，Li等[8]利用降解組測序技術，分別構建了頭茬與重茬地黃降解組文庫，鑒定了85個miRNAs家族165個靶基因，其靶基因功能分析表明：miRNAs可能參與了地黃的生長發育、信號傳導、營養物質的運輸、花器官的形成和逆境脅迫響應等多種生物學過程。

2miRNAs在地黃植株體內連作障礙形成中的調控機制

為尋找重茬地黃體內特異響應的miRNAs，Yang等[7，9]利用高通量測序技術構建了頭茬和重茬地黃miRNAs差異表達譜，初步篩選了32個響應連作障礙的miRNAs家族，之后，楊艷會[7，9]和Li等[8]先后重新構建了不同年份的頭茬和重茬地黃miRNAs差異表達譜，并結合前期研究的miRNAs差異表達譜，最終篩選了303個差異表達miRNAs家族。由于miRNAs負向調控著靶基因的表達，為鎖定響應連作關鍵的miRNAs家族，利用前期報道的頭茬與重茬地黃根及其葉差異基因表達譜，追蹤了連作障礙中特異表達85個miRNAs家族的靶基因，其結果表明：重茬地黃特異響應的46個miRNAs表達模式與其關鍵的靶基因表達模式可能存在著一致的負向調控關系[7，2021]。由此認為，重茬地黃體內自毒物質可能響應了特異miRNAs，改變了基因表達的程序，致使其體內一系列生命活動系統的紊亂而導致連作障礙，現將miRNAs在重茬地黃體內參與的主要生物學過程總結如下。

21miRNAs參與重茬地黃體內自毒物質響應的信號轉導途徑地黃miR1851家族靶基因之一是植物促分裂原活化蛋白激酶MAPK（mitogenactivated protein kinase），它是一類存在于真核生物體內的絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，它與MAPKK（mitogenactivated protein kinase kinase）和MAPKKK（mitogenactivated protein kinase kinase kinase）共同組成MAPK級聯信號通路，在生物體內基因的快速轉錄、離子通道的活性調節、細胞骨架結構的重新定位以及第二信使的產生等核心生命過程中發揮重要作用[2224]。在重茬地黃體內，miR1851過量表達，降解靶基因MAPK的堿基片段，抑制了重茬地黃體內MAPK級聯的下游信號傳遞，干擾了地黃體內多種生理活動。地黃miR4414家族鑒定的一個靶基因編碼鈣離子逆向運輸交換器（Ca2+ antiporter/cation exchanger），該蛋白負向調控著植物細胞內鈣離子的濃度[25]。鈣離子是植物逆境脅迫響應的重要信號系統，而細胞內鈣離子濃度的增加是植物脅迫響應的一個主要標志[26]。在重茬地黃體內根際化感自毒物質的積累及其效應可能是造成連作脅迫的主要因素[27]。在重茬地黃體內，自毒物質被細胞內鈣信號系統感知[21]和傳導，引起miR4414的過量表達，可能抑制了鈣離子逆向運輸交換器基因的表達，阻礙了鈣離子逆向運輸途徑，加強了重茬地黃體內鈣信號的傳導系統，使細胞內鈣離子濃度過高。由于胞內游離鈣水平的升高是植物體產生乙烯的一個啟動信號，可促進乙烯的合成[28]。而且，地黃miR830家族的一個靶基因編碼乙烯響應蛋白（ethyleneresponsive protein，ERP），在重茬地黃體內下調的miR830，可能激活了EPR基因的表達，Yang等[22]研究發現ERP基因在重茬地黃體內確實存在著下調表達。由此認為，重茬地黃體內自毒物質的信號轉導系統的加強，可以促進乙烯的合成，加速地黃衰老的進程。

22miRNAs參與重茬地黃體內的營養運輸途徑地黃miR1508家族的一個靶基因編碼氮轉運蛋白（nitrogen transporter NRT12），該蛋白位于細胞質膜，主要在氮離子從胞外向胞內轉運過程中發揮重要作用。在重茬地黃體內miR1508家族上調表達，抑制了NRT12基因的正常表達，可能干擾了胞內氮離子的輸入，抑制或減弱植物體內氮營養的吸收。而且地黃miR1861 和miR4356家族靶基因中均有一個編碼鉀轉運蛋白（potassium transporter）基因，它是鉀轉運蛋白家族的成員，在植物內具有鉀離子跨膜轉運蛋白活性[2930]。在煙草根部可促進K+吸收及其根部向地上部的運輸，該基因的正常表達能增強植物細胞抗逆性[3132]。重茬地黃體內miR1861和 miR4356家族的過量表達，抑制了PT7的活性，減弱了胞外鉀離子的跨膜運輸。以上這3個miRNAs家族在重茬地黃體內特異響應，擾亂了地黃體內氮和鉀離子的正常運輸，引起地黃體內營養元素的缺乏，植株發育不良，降低了重茬地黃的抗逆性。

23miRNAs參與重茬地黃細胞內的核心代謝過程miR7811家族一個靶基因編碼染色體結構維持（structural maintenance of chromosomes，SMC）蛋白，該蛋白主要參與有絲分裂染色體的集縮和分離、遺傳重組和DNA修復等過程[33]。重茬地黃體內miR7811的過量表達，降低了SMC基因的正常表達，可能會影響到染色體的有絲分裂及DNA修復等過程，使得細胞內的遺傳信息發生改變。miR163家族鑒定的一個靶基因編碼RNA指導的RNA聚合酶（RNAdirected RNA polymerase），是RNA轉錄過程中的關鍵酶，在RNA合成中起重要作用[3435]。Yang等[22]報道證實了RNA指導的RNA聚合酶基因在地黃連作障礙發生過程中的表達被抑制，尤其是塊根膨大前期，該基因幾乎不表達。在重茬地黃體內，響應連作的miR163過量表達，降解了與其互補的靶基因（RNA指導的RNA聚合酶）堿基片段，抑制了RNA指導的RNA聚合酶基因的表達，干擾了重茬地黃體內的RNA合成過程。miR531家族靶向的一個基因編碼60S 核糖體蛋白（60S ribosomal protein，RP60S），該蛋白參與mRNA翻譯蛋白的調控[3637]。miR531在重茬地黃體內過量表達，抑制了60S 核糖體基因的表達，miR531間接地抑制了植株體內蛋白的合成。以上這3個miRNA家族由自毒物質誘導而過量表達，可能使得地黃體內DNA復制、RNA及蛋白合成的核心代謝途徑被阻擾，擾亂了植株體內正常的代謝途徑。

24miRNAs參與重茬地黃須根的生成地黃miR160家族調控的靶基因是生長素響應因子（auxin response factor，ARF）ARF10和ARF16，它們調節著植物根冠細胞分裂和分化的平衡[3839]。在miR160過量表達的轉基因擬南芥中，ARF10 和ARF16 蛋白的缺失或減少使得根冠細胞分化受阻，分裂失控，形成類似于腫瘤的結構，并導致根尖干細胞群的異位擴大[38]。在重茬地黃體內miR160出現特異過量表達，miR160通過轉錄本特異剪切控制ARF10和ARF16的表達被抑制或關閉，可能使其根部細胞分化受到阻擾，抑制地黃根部發育，導致塊根不能正常膨大。地黃miR165家族的靶基因編碼HDZipⅢ 蛋白，該蛋白家族可能在植物頂端分生及側生分生組織的形成、側生器官極性建立等過程中扮演重要角色[40]。在擬南芥中，下調表達miR165啟動了HDZip Ⅲ基因過量表達，促進植物根部分生組織的木質部形成，產生較多側根[41]。在重茬地黃體內miR165家族下調表達，可能激活了HDZip Ⅲ 基因過量表達，促進植物根系側根的發生，即形成較多的須根，抑制了塊根膨大。地黃miR408家族靶基因編碼一個LBD（lateral organ boundaies domain）蛋白，該蛋白在植物側生組織的發育中起重要作用[4243]。在玉米中，LBD基因的過量表達促進了根系側根的形成[44]。重茬地黃體內miR408家族表達被抑制，激活了LBD基因的表達，誘導地黃根系須（側）根的形成，產生了較多的須根，抑制了地黃塊根的膨大。

25miRNAs參與重茬地黃植株開花及花器官的形成miR156/miR157家族靶基因是SPL（squamosa promoter binding proteinlike）家族基因，SPL可在轉錄水平直接激活開花基因AP1（APETALA1），FUL（FRUITFULL），SOC1（suppressor of overexpression of constans 1）的表達而誘導植物開花[4546]。在擬南芥中，miR156/157過量表達抑制SPL結構域基因表達量下降，延長植物營養生長時期而推遲開花[4647]。在重茬地黃體內，從塊根膨大前期到成熟期，miR156/157表達量與頭茬地黃相比，其表達量顯著下降，尤其在地黃塊根膨大前期，其表達量差異最顯著[79，48]。重茬地黃體內miR156/157的下調表達，可能啟動了SPL基因過量表達。Yang等[2021]前期研究發現，在連作障礙特異響應的基因中，SPL基因在重茬地黃體內上調表達，尤其是塊根伸長期，其表達量最高。由此表明：重茬地黃體內的miR156/157家族表達被抑制，促進了靶基因（SPL）過量表達，誘導地黃提前開花，縮短了植株的營養生長期，致使重茬地黃的營養器官塊根（發育）不良，加速植株早衰。而且，地黃miR167家族調控的靶基因是ARF家族中的ARF6，ARF8，它們參與調控植物花器和果實等生殖生長過程[49]。在擬南芥中，ARF6，ARF8過量表達促進花器官的發育[50]。在重茬地黃體內，miR167家族的表達被抑制，誘導了ARF6，ARF8基因的過量表達，可能促進了地黃花器官的發育，抑制了地黃根部發育，加速植株衰老。

3展望

地黃連作障礙特異表達miRNAs的發現與功能解析表明，重茬地黃體內自毒物質信號的誘導，很有可能響應了特異miRNAs的表達，改寫了基因正常表達程序，阻礙了核心代謝途徑，使植株全方位受害，引起了地黃的連作障礙。前期的研究為全面揭示地黃連作脅迫下miRNAs及其靶基因表達調控的本質提供強有力工具。深入研究miRNAs 的功能以及利用RNAi 干擾技術抑制關鍵miRNAs 的表達，并且根據關鍵miRNAs的分子調控機制，結合分子育種技術，以后可能選育出對化感物質不敏感的新品種，以及提高地黃的產量和質量，這對中藥產業的可持續發展具有重要的經濟價值。前期報道的地黃miRNAs是以mRNA轉錄本為基礎數據、主要存在于基因區域的miRNAs；由于地黃基因組序列未知，而基因間隔區和內含子區的miRNAs還未被發掘，這將意味著地黃體內仍存在著許多未知的響應連作障礙關鍵的miRNA家族正亟待我們發現。而且，另幾類新型的非編碼RNAs（lncRNAs，tasiRNAs，natsiRNAs）的發現和功能解析，也是現代生命科學的研究熱點，這將會豐富對地黃響應連作障礙的基因表達調控機制的認識，從多個角度更加深刻地理解地黃連作障礙分子調控的機制。

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