基于質量源于設計理念的金銀花水提液石灰乳沉淀工藝優化研究

沈金晶+龔行楚+潘堅揚+瞿海斌

[摘要]該研究采用設計空間法優化金銀花水提液的石灰乳沉淀工藝。該工藝的評價指標為6種有機酸總純度和單位質量藥材提取出的6種有機酸量。通過加權標準偏回歸系數法篩選出堿液滴加速度、調堿pH、靜置時間和靜置溫度為4個關鍵工藝參數。采用逐步回歸法建立工藝評價指標與關鍵工藝參數的定量模型。通過Monte Carlo算法計算出基于概率的設計空間并進行驗證。結果表明，在設計空間內操作能夠保證石灰乳沉淀工藝品質穩定。該研究推薦石灰乳沉淀工藝操作空間為：堿液滴加速度100～125 mL·min-1，調堿pH 115～117，靜置時間10～11 h，靜置溫度100～200 ℃。

[關鍵詞]金銀花； 石硫醇法； 石灰乳沉淀； 質量源于設計； 設計空間

[Abstract]Design space approach was applied in this study to optimize the lime milk precipitation process of Lonicera Japonica （Jinyinhua） aqueous extract The evaluation indices for this process were total organic acid purity and amounts of 6 organic acids obtained from per unit mass of medicinal materials Four critical process parameters （CPPs） including drop speed of lime milk， pH value after adding lime milk， settling time and settling temperature were identified by using the weighted standardized partial regression coefficient method Quantitative models between process evaluation indices and CPPs were established by a stepwise regression analysis A design space was calculated by a MonteCarlo simulation method， and then verified The verification test results showed that the operation within the design space can guarantee the stability of the lime milk precipitation process The recommended normal operation space is as follows： drop speed of lime milk of 100125 mL·min-1， pH value of 115117， settling time of 1012 h， and settling temperature of 1020 ℃

[Key words]Lonicera Japonica； lime milksulfuric acidethanol method； lime milk precipitation process； quality by design； design space

金銀花Lonicera japonica Thunb為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、疏散風熱之功效[1]。金銀花提取物可用于制備痰熱清注射液和茵梔黃膠囊等多種中藥，其質量控制常采用包含新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C等酚酸類成分的含測方法和特征圖譜[2]。

金銀花提取物制備過程常采用石硫醇法。石硫醇法分為石灰乳沉淀和硫酸溶解2個過程，先向金銀花水提液中加入石灰乳，使有機酸形成鈣鹽沉淀，過濾收集沉淀；隨后加入乙醇使沉淀混懸，再加硫酸使有機酸溶出，得到有機酸的醇溶液和硫酸鈣沉淀。該法操作簡單，自20世紀70年代起就已用于注射液的生產[3]，但該法有機酸收率較低，批次間一致性差，已有文獻報道中也缺乏系統的工藝研究。

近年來，質量源于設計（quality by design，QbD）理念在制藥領域獲得了日益廣泛的關注和應用。該理念強調對藥品及其生產工藝的理解，要求采用知識管理和風險管理，依靠原料質控和生產過程質控來控制藥品質量。QbD理念實施時常采用設計空間法（design space approach），該法能夠提供穩健生產的工藝參數范圍，確保產品質量的一致性，目前已用于提取、醇沉、水沉和柱色譜等工藝的參數優化[410]。

本研究基于QbD理念，采用設計空間法優化金銀花水提液石灰乳沉淀工藝，以加權標準偏回歸系數法篩選關鍵工藝參數[11]，建立工藝評價指標和關鍵工藝參數的定量模型，利用Monte Carlo算法獲得基于概率的設計空間并進行驗證。

1材料

pH計（S40 SevenMulti，瑞士MettlerToledo公司）；低溫恒溫槽（THD1008W，寧波天恒儀器廠）；旋轉蒸發儀（R200，德國BUCHI公司）；恒溫水浴槽（B490，德國BUCHI公司）；注射泵（LSP021B，保定蘭格恒流泵有限公司）；數顯測速電動攪拌器（JJ1A，常州潤華電器有限公司）；磁力攪拌器（851，杭州儀表電機有限公司）；精密電子天平（XS105 DualRange，瑞士MettlerToledo公司）；電熱恒溫鼓風干燥器（DHG9146A，上海精宏實驗設備有限公司）；高效液相色譜儀（1260，德國Agilent公司），配四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、OpenLAB ChemStation工作站。

金銀花藥材由上海凱寶藥業股份有限公司提供（產地河南封丘縣，批號160302）；用于標準曲線配置的新綠原酸對照品（純度>99%，140106），綠原酸對照品（純度>99%，140311），隱綠原酸對照品（純度>99%，140224），咖啡酸對照品（純度>99%，140219），異綠原酸B對照品（純度>99%，140309），異綠原酸A對照品（純度>99%，140221），異綠原酸C對照品（純度>99%，130428）均購自上海融禾醫藥科技有限公司；用于加樣回收樣品配置的新綠原酸對照品（純度>99%，160904），綠原酸對照品（純度>99%，160927），隱綠原酸對照品（純度>99%，160917），咖啡酸對照品（純度>99%，161021），異綠原酸B對照品（純度>99%，160925）；異綠原酸A對照品（純度>98%，161026），異綠原酸C對照品（純度>98%，161020）均購自上海融禾醫藥科技有限公司；氫氧化鈣（分析純，建德市新安江重鈣廠）；鹽酸（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；色譜純乙腈、甲醇均購自Merck公司；去離子水由水超純水系統（MilliQ，德國Millipore公司），每日新制。

2方法

21金銀花水提濃縮液制備及石灰乳沉淀步驟

稱取150 g金銀花藥材，分別加225 L水和150 L水煎煮2次，第1次煎煮1 h，第2次煎煮05 h，濾過，合并濾液，將濾液濃縮至450 mL，冷凍儲存備用。

用磁力攪拌器在冰浴條件下配置一定濃度石灰乳，配完后繼續攪拌備用。濃縮液在常溫下解凍后搖勻，量取約100 mL至250 mL燒杯中，在機械攪拌下用注射泵以一恒定速度滴加石灰乳，加完后繼續攪拌30 min，再將燒杯用保鮮膜密封，在低溫恒溫槽中靜置一定時間。將燒杯取出后立即抽濾，收集沉淀后稱重。取部分沉淀分析有機酸含量及固含量，其余冷凍保存。

22分析方法及方法學驗證

沉淀和濃縮液中有機酸含量采用HPLC測定[12]。沉淀樣品的前處理方法如下：取鈣鹽沉淀約12 g，用50 mL乙醇混懸，加入6%的鹽酸溶液將pH調至10，使鈣鹽沉淀基本溶解，抽濾，取5 mL濾液濃縮至干，用50%甲醇溶解并定容至10 mL量瓶，進行HPLC分析。

HPLC分析條件：色譜柱為Agilent Zorbax SBC18柱（46 mm×250 mm，5 μm）；以01%甲酸水溶液為流動相A，01%甲酸乙腈溶液為流動相B，進行梯度洗脫，0～25 min，8%B，25～30 min，8%～19%B，30～60 min，19%B，60～61 min，19～90%B，61～65 min，90%B；檢測波長325 nm；流速1 mL·min-1；進樣量10 μL；柱溫25 ℃。

對照品溶液配制方法如下：精密稱取新綠原酸對照品508 mg，綠原酸對照品563 mg，隱綠原酸對照品 494 mg，咖啡酸對照品1172 mg，異綠原酸B 對照品489 mg，異綠原酸A對照品 491 mg，異綠原酸C對照品 487 mg，以50%甲醇超聲溶解并定容至5 mL量瓶，作為標準曲線最高濃度溶液，逐步稀釋至標準曲線各濃度溶液。

加樣回收率樣品制備方法：精密稱取新綠原酸對照品379 mg，綠原酸對照品3561 mg，隱綠原酸對照品698 mg，咖啡酸對照品045 mg，異綠原酸B 對照品674 mg，異綠原酸A對照品806 mg，異綠原酸C對照品947 mg，以50% 甲醇超聲溶解并定容至25 mL量瓶，作為加樣回收對照品儲備液。取金銀花提取液1 mL，共9份，精密稱定，分別加入06，10，14 mL加樣回收對照品儲配液，以50%甲醇超聲溶解并定容至5 mL，配成80%，100%，120%濃度的加樣回收樣品，每個濃度樣品平行制備3份，進行HPLC分析。

總固體含量測定采用質量法[13]。取鈣鹽沉淀約2 g或濃縮液約05 mL，精密稱量，然后置于已恒重的稱量瓶內，在鼓風干燥箱內105 ℃干燥3 h，放入干燥器內冷卻至室溫，再次稱量。根據樣品干燥后質量計算樣品中總固體含量。

23試驗設計

231工藝評價指標為考察金銀花水提液中的有機酸轉移到鈣鹽沉淀情況，將每1 g藥材提取出的新綠原酸量（Y1）、綠原酸量（Y2）、隱綠原酸量（Y3）、異綠原酸B量（Y4）、異綠原酸A量（Y5）、異綠原酸C量（Y6）作為工藝評價指標。

同時，為考察金銀花水提液中雜質除去程度，將以上6種有機酸的總純度（Y7）也作為工藝評價指標，計算公式如下。總有機酸純度=樣品中6種有機酸總量1樣品總固體量×100%（1）232關鍵工藝參數篩選采用PlackettBurman設計考察堿液滴加速度、調堿pH、調堿攪拌速度、石灰乳質量濃度、石灰乳攪拌速度、靜置時間、靜置溫度等7個工藝參數對金銀花石灰乳沉淀過程的影響，各因素和相應水平見表1，具體條件見表2。試驗設計由JMP11（美國SAS公司）完成。

33石灰乳沉淀工藝建模采用BoxBehnken設計研究石灰乳沉淀過程關鍵工藝參數和工藝評價指標的定量關系。調堿攪拌速度固定為400 r·min-1，石灰乳濃度固定為20%，石灰乳攪拌速度固定為450 r·min-1。其他參數見表3，試驗設計由Design Expert 806（美國StatEase公司）完成。

其中a0，k為常數項，xi為工藝參數編碼值，為參數Xi對指標Yk的標準偏回歸系數。然后將各標準偏回歸系數的絕對值加權求和。作者認為單位質量藥材提取出的有機酸量和總有機酸純度同等重要，各占1/2權重，因此加權標準偏回歸系數絕對值之和采用下式計算。

Axi=1112×6k=1|axi，k|+112×axi，7（4）

其中為參數Xi對7個工藝評價指標的偏回歸系數加權之和，取加和值較大的前4項對應的參數作為關鍵工藝參數。

關鍵工藝參數與工藝評價指標之間的數學模型采用下式計算。

Y=b0+4i=1bixi+4j=1bjx2j+3i=14j=i+1bijXiXj（5）

其中，b0為常數項，bi，bj，bij為偏回歸系數。采用逐步回歸法簡化方程，模型移入或移除特定項的P設定為010。多元線性回歸和逐步回歸均采用DesignExpert806（美國StatEase公司）計算。

采用模擬重復試驗結果的Monte Carlo法計算設計空間[7，9]，由MatlabR2014a（美國MathWorks公司）自編程序進行計算。假設在某特定工藝條件下，多次重復試驗所得工藝評價指標的值符合正態分布，其平均值與試驗結果相同，相對標準偏差根據中心點相對標準偏差確定。計算時隨機模擬各指標的值，通過逐步回歸法建模并預測，統計不同工藝參數組合下預測結果的達標情況，取達標概率大于或等于080的組合為設計空間。計算中將關鍵工藝參數變化步長設為002，模擬次數為15 000次。

3結果與討論

31有機酸含量測定分析方法學驗證

根據本研究樣品的實際情況，對文獻[12]方法進行方法學驗證，標準曲線及線性范圍考察結果見表4，加樣回收考察結果見表5，對照品及提取液樣品HPLC圖見圖1。各有機酸80%，100%，120%濃度的平均回收率在9770%～1062%，RSD均小于35%，證明該分析方法準確、可靠，可用于本研究中樣品有機酸的含量測定。

32關鍵工藝參數篩選

PlackettBurman設計所得結果見表2。單位質量藥材提取出的綠原酸量、異綠原酸B量、異綠原酸A量、異綠原酸C量分別為292～643，065～129，072～149，191～513 mg，與純化前的181，149，370，540 mg相比均明顯減少，說明這4種成分在純化過程中損失較大。已有文獻報道新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸在強堿性條件下易發生降解轉化[1516]，所以推測有機酸損失主要原因為石灰乳加入后有機酸產生降解。總有機酸純度在343%～706%，而濃縮液中為838%，也有明顯下降。

公式（4）中各指標相應的模型標準偏回歸系數及其絕對值之和值見表6。由表可知，堿液滴加速度（X1）、調堿pH（X2）、靜置時間（X3）、靜置溫度（X4）的偏回歸系數絕對值之和大于另外3項，因此認為它們是石灰乳沉淀過程關鍵工藝參數。

33關鍵工藝參數的影響規律

BoxBehnken設計所得結果見表3，并以公式

（5）建立工藝評價指標與關鍵工藝參數的定量模型。模型的偏回歸系數及方差分析結果見表7。各模型的R2在080～088，說明模型能解釋大部分變異。除異綠原酸C指標外，調堿pH對其他指標都有顯著影響；靜置時間對所有指標均有顯著影響；除異綠原酸A和異綠原酸C指標外，靜置溫度對其他指標都有顯著影響。除純度外，堿液滴加速度和調堿pH的交互作用對其他指標均有顯著影響；除新綠原酸和綠原酸指標外，靜置時間和靜置溫度的交互作用對其他指標均有顯著影響。

由于工藝參數對新綠原酸量、隱綠原酸量、異綠原酸B量、異綠原酸A量和異綠原酸C量的影響規律類似，因此以新綠原酸量為例進行說明。新綠原酸量等高線圖見圖2，結合偏回歸系數的數值，見表7，可知：堿液滴加速度越快，調堿pH越低，靜置時間越短，靜置溫度越低，新綠原酸量越高。

綠原酸量等高線圖見圖3，堿液滴加速度越快，調堿pH越高，靜置時間越短，靜置溫度越低，綠原酸量越高。

純度等高線圖見圖4，結合表7中偏回歸系數的數值可知：調堿pH越低，靜置時間越短，靜置溫度越低，總有機酸純度越高。

靜置時間1 h，靜置溫度20 ℃。

a靜置時間1 h，靜置溫度20 ℃；b堿液滴加速度125 mL·min-1，靜置溫度20 ℃；c堿液滴加速度125 mL·min-1，靜置時間1 h； d 堿液滴加速度125 mL·min-1，pH 120。

堿液滴加速度125 mL·min-1，pH 120。

34設計空間及驗證

工藝評價指標的可接受范圍及達標概率見表8。通過Monte Carlo算法計算得到設計空間，見圖5。為便于操作，推薦設計空間內操作空間為：堿液滴加速度100～125 mL·min-1，調堿pH 115～117，靜置時間10～11 h，靜置溫度100～200 ℃。該操作空間內工藝評價指標的最低達標概率為0800。

為驗證設計空間的準確性，分別在設計空間內、外取一點進行驗證，記為V1，V2。驗證點實驗條件及結果見圖5，表9。由驗證結果可知，實測值與預測值基本符合，證明模型預測性能良好。設計空間內驗證點完全達標，而設計空間外驗證點的總有機酸純度和異綠原酸C量不能達標，說明在設計空間內操作能保證石灰乳沉淀工藝品質穩定可靠。

a堿液滴加速度為125 mL·min-1；bpH 115；c堿液滴加速度125 mL·min-1，靜置溫度20 ℃；△設計空間內驗證點；×設計空間外驗證點；彩條指所有指標均達標的概率值。

4結論

本研究通過設計空間法優化金銀花水提液石灰乳沉淀工藝。首先確定工藝評價指標為純度、單位

質量藥材提取出的新綠原酸量、綠原酸量、隱綠原酸量、異綠原酸B量、異綠原酸A量和異綠原酸C量；隨后，通過加權標準偏回歸系數法篩選出堿液滴加速度、調堿pH、靜置時間和靜置溫度為4個關鍵工藝參數；再采用逐步回歸法建立工藝評價指標與關鍵工藝參數的定量模型；最后，通過Monte Carlo算法計算出基于概率的設計空間并驗證。驗證結果證明在該工藝參數設計空間內操作能夠保障石灰乳沉淀過程質量穩定。為便于操作，推薦金銀花水提液石灰乳沉淀工藝的操作空間為：堿液滴加速度100～125 mL·min-1，調堿pH 115～117，靜置時間10～11 h，靜置溫度100～200 ℃。