ABAT基因多態(tài)性對(duì)癲癇患兒丙戊酸鈉血藥濃度的影響

張貴萍，楊冰竹，李磊，趙靜，潘煥，張?jiān)泼?/p>

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

ABAT基因多態(tài)性對(duì)癲癇患兒丙戊酸鈉血藥濃度的影響

張貴萍，楊冰竹，李磊，趙靜，潘煥，張?jiān)泼?/p>

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003)

目的觀察ABAT基因多態(tài)性對(duì)癲癇患兒丙戊酸鈉血藥濃度的影響。方法收集癲癇患兒80例，單用丙戊酸鈉10～30 mg/kg治療5個(gè)半衰期(約100 h)后達(dá)到穩(wěn)態(tài)；取外周靜脈血，采用熒光偏振免疫法測(cè)定丙戊酸鈉血藥濃度，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性計(jì)數(shù)分析ABAT(rs1731017、rs1641022)基因多態(tài)性，比較不同基因型對(duì)丙戊酸鈉血藥濃度的影響，用多元線性回歸分析影響丙戊酸鈉血藥濃度的因素。結(jié)果80例患者中，ABAT rs1731017位點(diǎn)AA、GG、GA基因型分別為23、23、34例，ABAT rs1641022位點(diǎn)CC、AA、CA基因型分別為11、27、42例。血藥濃度為(48.15±20.99)μg/mL，其中ABAT rs1731017位點(diǎn)AA基因型為(36.41±20.12 )μg/mL，低于GG基因型患兒的(53.26±22.99)μg/mL(P<0.05)，ABAT rs1641022各基因型患兒血藥濃度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。多元線性回歸分析顯示，患兒體質(zhì)量及ABAT rs1731017A/G多態(tài)性是影響丙戊酸鈉血藥濃度的獨(dú)立因素。結(jié)論ABAT rs1731017基因多態(tài)性對(duì)丙戊酸鈉的血藥濃度存在影響，對(duì)AA基因型癲癇患兒可適當(dāng)增加藥物的劑量。

癲癇；丙戊酸鈉；ABAT基因；基因多態(tài)性；血藥濃度;兒童

癲癇是臨床上常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，我國(guó)癲癇發(fā)病率約為0.7%，其中60%于小兒時(shí)期起病[1]。丙戊酸鈉(VPA)是一線傳統(tǒng)抗癲癇藥之一，其對(duì)全面性癲癇的失神發(fā)作、肌陣攣和強(qiáng)直-陣攣發(fā)作都有一定療效；但是，丙戊酸鈉有治療指數(shù)低、安全范圍窄、療效個(gè)體差異大等缺點(diǎn)，此外遺傳因素也對(duì)其代謝及藥效有明顯影響。丙戊酸鈉是一種代謝途徑及作用機(jī)制非常復(fù)雜的藥物，涉及到多種代謝途徑。目前研究比較多的是Ⅰ相細(xì)胞色素P450酶(CYP450)的代謝和Ⅱ相尿苷酸二磷酸葡萄糖醛酸酶(UGT)的羧化作用[2，3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，丙戊酸鈉能提高抑制神經(jīng)遞質(zhì)γ氨基丁酸(GABA)水平從而發(fā)揮抗癲癇作用，其主要途徑是通過(guò)抑制γ氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABAT)活性。ABAT基因是GABAT的編碼基因，存在rs1731017A/G、rs1641022C/A突變[5]。為此，本研究應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)170例丙戊酸鈉單藥治療的癲癇患兒ABAT基因多態(tài)性進(jìn)行分析，評(píng)估ABAT基因多態(tài)性對(duì)丙戊酸鈉代謝的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年8月～2014年8月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診的癲癇病患兒80例，男40例、女40例，年齡(4.16±1.85)歲，體質(zhì)量(9.96±3.98)kg，均經(jīng)詢問(wèn)臨床癥狀、神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查、腦電圖、頭部CT/MRI檢查后確診為癲癇，每年發(fā)作頻率超過(guò)2次。排除就診前有使用其他抗癲癇藥物者，肝腎功能異常者，有結(jié)構(gòu)性或進(jìn)行性腦部疾病者，合并其他遺傳代謝疾病者，資料不全、依從性差者。本研究所有患兒或其監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)，并取得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 丙戊酸鈉服用方法及血藥濃度監(jiān)測(cè) 單藥服用丙戊酸鈉糖漿(德巴金，杭州賽諾菲安萬(wàn)特民生制藥有限公司)，日劑量為10～30(15.52±5.58)mg/kg。患兒在服藥后經(jīng)5個(gè)半衰期(約100 h)后達(dá)到穩(wěn)態(tài)，于清晨空腹服藥前采血4 mL，將一半血液置于普通試管中用于丙戊酸鈉血藥濃度的測(cè)定。應(yīng)用西門子血藥濃度檢測(cè)儀采用熒光偏振免疫法(FPIA)測(cè)定丙戊酸鈉血藥濃度，每份標(biāo)本測(cè)2次，取其平均值。為消除患兒體質(zhì)量和服藥劑量對(duì)血藥濃度的偏差，將檢測(cè)的血藥濃度除以患兒每日每公斤體質(zhì)量的服藥量得到患兒的標(biāo)準(zhǔn)血藥濃度。

1.3 ABAT rs1731017、rs1641022基因多態(tài)性分析 將血液標(biāo)本的另外一半置于EDTA抗凝試管中4 ℃保存，在2 h內(nèi)用DNA提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)完成DNA樣本提取，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測(cè) ABAT rs1731017、rs16410222位點(diǎn)的多態(tài)性。采取Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，ABAT rs1731017上游引物為5′-TATGATGGGCCTCTGATGAAG-3′、下游引物為 5′-CTAAGCTTGGCTGTGCCTTTG-3′，rs16410222上游引物為 5′-CTCCCACGGGTGTTTATTTCT-3′、下游引物為5′-GCTCCAACTCACAGCATTAGG-3′，由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系：DNA模板60 ng，上下游引物濃度均為0.2 μmol/L，dNTPs濃度為200 μmol/L，1×buffer及1 U TaqDNA聚合酶，加入去DNA酶水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；4 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物由3%瓊脂糖凝膠電泳定性。ABAT基因型判斷標(biāo)準(zhǔn)：rs1731017A/G、rs1641022C/A相應(yīng)產(chǎn)物分別經(jīng)AvaⅠ和RsaⅠ內(nèi)切酶(大連寶生物公司)37 ℃水浴過(guò)夜，用3%瓊脂糖凝膠電泳分離，根據(jù)分離片段長(zhǎng)度判斷基因型。ABAT rs1731017 基因型AA(126 bp)、AG(126、46、80 bp)、GG(46、80 bp)，ABAT rs1641022 基因型AA(224 bp)、AC(224、150、74 bp)、CC(150、74 bp)。

2 結(jié)果

2.1 癲癇患兒ABAT rs1731017、rs1641022基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果 ABAT rs1731017位點(diǎn)AA基因型23例(28.75%)、GG基因型23例(28.75%)、GA基因型34例(42.50%)，ABAT rs1641022C位點(diǎn)CC基因型11例(13.75%)、AA基因型27例(33.75%)、CA基因型42例(52.50%)。

2.2 癲癇患兒血藥濃度檢測(cè)結(jié)果 80例癲癇患兒血藥濃度為(48.15±20.99)μg/mL，其中ABAT rs1731017位點(diǎn)AA、GG、GA基因型分別為(36.41±20.12 )、(53.26±22.99)、(47.94±18.99)μg/mL，ABAT rs1641022位點(diǎn)CC、AA、CA基因型分別為(43.69±18.78)、(51.15±22.83)、(49.15±21.24)μg/mL。ABAT rs1731017位點(diǎn)AA基因型患兒血藥濃度低于GG型患兒(P<0.05)，其余同位點(diǎn)不同基因型間兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 癲癇患兒ABAT rs1731017、rs1641022基因多態(tài)性與血藥濃度的關(guān)系 通過(guò)多元線性回歸分析患者性別、年齡、體質(zhì)量、日劑量、ABAT rs1641022C/A多態(tài)性、ABAT rs1731017A/G多態(tài)性對(duì)丙戊酸鈉血藥濃度的影響，僅有患者體質(zhì)量(Sb= 0.008，bi=0.837，P=0.000)及ABAT rs1731017A/G多態(tài)性(Sb=0.045，bi=-0.136，P=0.038)2個(gè)因素納入回歸方差。回歸方程為丙戊酸鈉血藥濃度(μg/mL)=0.629+0.110×體質(zhì)量(kg)-0.095×ABAT rs1731017A/G(AA=1、GG=2、GA=3)。

3 討論

丙戊酸鈉是一種廣譜抗癲癇藥，廣泛應(yīng)用于癲癇的治療中，尤其適用于全面性癲癇，常作為一線抗癲癇藥物使用；但是，在臨床使用過(guò)程中存在療效差異性大的缺點(diǎn)。兒童患者肝腎功能尚未完全發(fā)育，比成年人更容易出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)。丙戊酸鈉的不良反應(yīng)往往與其血藥濃度有著密切的關(guān)系。丙戊酸鈉血藥濃度的影響因素比較多，患兒的遺傳因素、生理特征、病理因素及患兒的服藥依從性是導(dǎo)致血藥濃度變化的重要因素[6，7]。本研究通過(guò)多元線性回歸發(fā)現(xiàn)，患兒的體質(zhì)量及ABAT rs1731017A/G多態(tài)性都會(huì)對(duì)血藥濃度產(chǎn)生影響。

研究[8]發(fā)現(xiàn)，體質(zhì)量低于10 kg者丙戊酸鈉血藥濃度與劑量低度相關(guān)，而體質(zhì)量大于30 kg則二者存在中度相關(guān)，說(shuō)明體質(zhì)量與血藥濃度存在密切的關(guān)系。本研究也得到了類似的結(jié)論。其原因可能是體質(zhì)量越小的低齡兒童代謝旺盛，其藥物清除速率越快，血藥濃度就越低。因此，對(duì)于年齡小、體質(zhì)量低者應(yīng)該適當(dāng)增加單位劑量以獲得更穩(wěn)定的血藥濃度水平，保證抗癲癇治療效果；而體質(zhì)量偏大者則應(yīng)選擇偏小的單位劑量，保證療效的同時(shí)避免產(chǎn)生藥物不良反應(yīng)。

丙戊酸鈉在體內(nèi)主要有三種代謝途徑，其中40%是通過(guò)線粒體β氧化。各種代謝途徑均涉及到多條藥理通路，多種受體和通道參與其中，如鈉離子通道基因、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑、ABAT基因、鈣離子T型阻滯劑的CACNA1I、CACNA1H等等[11]。 因此，編碼這些酶和受體的基因突變都會(huì)引起丙戊酸鈉的代謝發(fā)生變化，從而使得患者在療效上存在巨大差異。 ABAT基因位于16號(hào)染色體的13區(qū)2帶，其主要功能是編碼GABAT參與GABA的分解代謝[9]。當(dāng)GABAT不足時(shí)，就會(huì)引起GABA含量升高，出現(xiàn)神經(jīng)精神興奮性的癥狀，如難治性的癲癇發(fā)作和腦電圖的異常。Barnby等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ABAT基因表達(dá)水平與GABAT的活性存在一定的關(guān)聯(lián)。當(dāng)ABAT基因發(fā)生多態(tài)性改變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致GABAT水平發(fā)生改變，從而導(dǎo)致GABA含量發(fā)生改變，從而影響丙戊酸鈉的代謝及臨床療效。

此外，ABAT還能促進(jìn)二磷酸脫氧核糖核苷轉(zhuǎn)化為三磷酸脫氧核糖核苷，這樣能夠維持線粒體膜的功能和線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABAT rs1641022中等位基因C的頻率是28.75%、等位基因A的頻率是66.25%，ABAT rs1731017A/G中等位基因G頻率是50.00%、等位基因A的頻率是50.00%，此結(jié)果與其他學(xué)者研究結(jié)果類似[5]。本研究顯示，ABAT rs1731017A/G(Gln/Arg)中AA型攜帶者比GG型攜帶者標(biāo)準(zhǔn)化的丙戊酸鈉血藥濃度顯著降低。其原因可能是由于基因的突變，導(dǎo)致其編碼的氨基酸發(fā)生改變。谷氨酸(Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，腦內(nèi)Glu水平增高與癲癇有著密切的關(guān)系。有研究[13]證實(shí)，丙戊酸鈉通過(guò)調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的Glu釋放水平從而控制Glu能神經(jīng)元的活性，達(dá)到治療癲癇的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ABAT rs1731017A/G由于基因的突變，導(dǎo)致其編碼Gln的含量不同。Gln是神經(jīng)元合成Glu的原料，從而導(dǎo)致丙戊酸鈉血藥濃度的改變。因此認(rèn)為，ABAT的多態(tài)性與兒童癲癇患者丙戊酸鈉的代謝有密切關(guān)系，是影響患兒丙戊酸鈉血藥濃度及臨床療效的一個(gè)重要因素。但是本組也存在一定的局限之處：首先樣本量較小，可以擬擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究；另外，癲癇是一種多基因共同影響的疾病，受到多條通路多個(gè)基因的調(diào)控，而且環(huán)境因素也會(huì)對(duì)療效產(chǎn)生一定的影響。因此，ABAT基因多態(tài)性對(duì)癲癇患兒丙戊酸鈉血藥濃度的影響尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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本刊2017年57卷第30期104～107頁(yè)文章《尿源性干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用進(jìn)展》中，基金項(xiàng)目為江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程一期項(xiàng)目(PPZY2015B161)，通信作者為陳鳳鴻(E-mail: 254279976@qq.com )。特此聲明。

本刊編輯部

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.021

R725.9

B

1002-266X(2017)34-0065-03

2017-03-24)