Semaphorin 5A 在皮膚黑素瘤組織中的表達及與其惡性程度的相關性

謝玉燕，張莉，李凌佳，吳文娟，劉彤云(昆明醫科大學第一附屬醫院,昆明650032)

Semaphorin 5A 在皮膚黑素瘤組織中的表達及與其惡性程度的相關性

謝玉燕，張莉，李凌佳，吳文娟，劉彤云
(昆明醫科大學第一附屬醫院,昆明650032)

目的 觀察Semaphorin 5A在皮膚黑素瘤(CMM)組織中的表達情況,并探討其與CMM惡性程度的相關性。方法 選擇20例CMM患者和20例黑素細胞痣者的石蠟包埋組織標本。CMM患者根據Clark(1969)分級方法，Ⅰ級3例(15.00%)、Ⅱ級3例(15.00%)、Ⅲ級4例(20.00%)、Ⅳ級7例(35.00%)、Ⅴ級有3例(15.00%) 。免疫組化法檢測Semaphorin 5A在CMM及黑素細胞痣皮損組織中的表達，比較不同病理分級的CMM間Semaphorin 5A表達的差異。結果 Semaphorin 5A在CMM中的陽性表達率(80.00%，16/20)高于黑素細胞痣中的陽性表達率(5.00%，1/20)(P<0.05)；且Semaphorin 5A在CMM中的表達與Clark分級呈正相關(P<0.05)。結論 Semaphorin 5A在CMM組織中的表達升高，與CMM惡性程度有關。

黑素瘤；Semaphorin 5A；免疫組織化學

皮膚黑素瘤(CMM)是一種高度惡性的皮膚腫瘤，其源于黑素細胞，是由外胚層神經嵴產生分化而來。Semaphorin 5A是神經導向分子Semaphorins家族中的一員，該基因已經被證實在胃癌組織中高表達，Semaphorin 5A與plexin B3結合促進胃癌的發展，并影響其侵襲和轉移。Woodhouse等[1]在人類黑色素瘤細胞A2058的膜提取物中檢測到Semaphorin 5A的表達。而該基因是否在CMM瘤組織中表達及其在瘤細胞中的作用尚未明確。本試驗采用免疫組化法檢測Semaphorin 5A在CMM瘤組織及黑素細胞痣中的表達，并初步分析Semaphorin 5A表達與CMM惡性程度之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009～2015年昆明醫科大學第一附屬醫院皮膚科確診的20例CMM患者和20例黑素細胞痣者的石蠟包埋組織標本。20例CMM患者中，男8例、女12例，男女比例2∶3。發病年齡32～73歲、平均年齡57.9歲，其中45歲以上者占85%。發生于面部2例(10.00%)、軀干1例(5.00%)、手臂1例(5.00%)、肢端16例(80.00%)。多數患者自述惡變前無明顯誘因，患者自述惡變前有明確外傷史3例(15.00%)，曾外用刺激性藥物如雙氧水、雞眼膏者1例(5.00%)。皮損多為突出的黑色結節、腫塊或在黑色斑疹近期突然增大隆起，色素加深，出現糜爛甚至潰瘍，部分患者皮損周圍出現黑褐色斑疹呈衛星樣分布。其中皮損表現為黑色斑片者5例，斑塊者3例，黑色結節者5例，潰瘍者7例。Clark(1969)病理分級方法參照文獻[2]：根據浸潤深度將CMM分為5級：Ⅰ級：瘤細胞限于基底膜以上的表皮內(原位CMM)；Ⅱ級：瘤細胞突破基底膜侵犯到真皮乳頭層；Ⅲ級：瘤細胞充滿真皮乳頭層，并進一步向下侵犯，未到真皮網狀層；Ⅳ級：瘤細胞已侵犯到真皮網狀層；Ⅴ級：瘤細胞已穿過真皮網狀層，侵犯到皮下脂肪層。

1.2 組織中Semaphorin 5A蛋白表達的檢測 采用免疫組化法。組織標本均經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規制片。將石蠟包埋組織標本制成連續切片，厚度為4～6 μm，然后經二甲苯脫蠟，抗原修復，DAB顯色，全部過程嚴格按照試劑盒說明書進行操作，所用一抗為Semaphorin 5A蛋白多克隆抗體(1∶300)。Semaphorin 5A陽性對照圖片為試劑公司提供，并以PBS代替一抗作為陰性對照。

Semaphorin 5A陽性評價標準：陽性表達于細胞質或(和)細胞膜，呈棕黃或黃褐色顆粒。隨機選取陽性細胞密度高的區域5 個高倍視野(×400)計數，通過對顏色的強弱及陽性細胞的個數進行評分:沒有變色為0分，淺黃色1分，淺褐色2分，褐色3分；陽性細胞數 <5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項評分相加，并分為4個等級，0～1分為-，2分為+，3～4分++，>5分+++，結果由兩名病理科醫生采用雙盲原則判定。

1.3 統計學方法 采用 SPSS19.0統計軟件。計數資料以頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗；Semaphorin 5A與CMM惡性程度等級相關性分析采用Kendall′ tau-c相關性分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CMM組織病理學表現及Clark(1969)分級結果 20例CMM石蠟組織經HE染色，顯微鏡下可見表皮及真皮分布異形的黑素瘤細胞，沿水平方向和(或)垂直方向生長，侵入真皮及皮下，細胞形態不一，大小不同，有核分裂相出現，部分瘤細胞見明顯核仁，并可有色素顆粒沉積。根據Clark(1969)分級方法:Ⅰ級3例(15.00%)，Ⅱ級3例(15.00%)，Ⅲ級4例(20.00%)，Ⅳ級7例(35.00%)，Ⅴ級3例(15.00%) 。臨床表現為斑片者Clark分級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級者3、1、1例，斑塊者Clark分級為Ⅱ、Ⅲ級者2、1例，結節者Clark分級為Ⅲ、Ⅳ級者1、4例，潰瘍者Clark分級為Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ級者1、3、3例，經過臨床及病理學分析發現，臨床僅表現為黑斑的CMM多為Ⅰ級或 Ⅱ級，臨床為斑塊或黑色結節的CMM多為Ⅲ級及Ⅳ級，而出現潰瘍的CMM多為Ⅳ級及以上。

2.2 Semaphorin 5A在CMM及黑素細胞痣中的表達比較 Semmaphorin 5A陽性表達主要定位于細胞質和(或)細胞膜，呈棕黃色、褐色。20例CMM中，Semaphorin 5A蛋白表達+++者9例、++者7例、+者3例、陰性者1例，陽性率為80.00%(16/20)。20例黑素細胞痣中，Semaphorin 5A蛋白表達++者 1例、+者 4例、陰性者15例，陽性率5%(1/20)。兩者Semaphorin 5A蛋白表達陽性率比較，χ2=23.02，P<0.05。

2.3 Semaphorin 5A在CMM患者中的表達與腫瘤侵襲程度相關性 CMM Ⅰ級患者中Semaphorin 5A表達為-、+、++、+++者分別為1、2、0、0例，Ⅱ級者中分別為0、1、1、1例，Ⅲ級者中分別為0、0、1、3例，Ⅳ級者中分別為0、0、4、3例，Ⅴ級者中分別為0、0、1、2例，Semaphorin 5A在CMM瘤組織中的表達與腫瘤的Clark分級呈正相關(r=0.6，P<0.05)。

3 討論

CMM是由于黑素細胞過度增生引起的一種高度惡性的皮膚腫瘤，其源于黑素細胞，是由外胚層神經嵴產生分化而來。CMM的發生與免疫、遺傳、創傷、環境因素有關，好發于45歲以上中年人及中老年人，青少年發病者甚少，兒童罕見[3]。本研究結果也證實，CMM好發于四肢末端，主要發病人群為45歲以上中老年患者，某些刺激或外傷可能造成黑素細胞痣的惡變，與文獻報道基本一致。近年CMM發病率逐年增加。資料顯示，全世界CMM在近30年間增長了60%，我國每年約有新發病例2萬，其轉移速度快，預后差及病死率高，目前已成為惡性程度最高的皮膚腫瘤[3,4]。CMM淋巴轉移和血行轉移發生早，腫瘤轉移患者的治療效果并不理想，5年生存率只有14%[5]。

CMM的病理表現為表皮及真皮分布異形的黑素瘤細胞，一般為梭形細胞或上皮樣細胞等各種細胞形態，侵入真皮及皮下，瘤細胞可見有核分裂相出現，并可有色素顆粒沉積。Clark(1969)分級對CMM的病理浸潤深度進行了分級，分級越高，預后越差。本研究結果顯示，臨床僅表現為黑斑的CMM多為Ⅰ級或Ⅱ級，臨床為斑塊或黑色結節的CMM多為Ⅲ級及Ⅳ級，而出現潰瘍的CMM多為Ⅲ級及以上。

Semaphorins是一個包含了30多個成員的神經軸突導向分子大家族，根據來源、種屬與結構的異同，將Semaphorins分為8個亞家族[6]。其中Semaphorin 5是惟一既存在于脊椎動物(Semaphorin 5A和Semaphorin 5B)又存在于無脊椎動物(Semaphorin 5C)中的亞家族[7，8]。Semaphorins家族成員結構上具有一定的相似性，即在N-端含有一個高度保守的、富含半胱氨酸殘基的“sema”域，長為400～500個氨基酸[9]。而Semaphorin 5A作為該家族中的一員，其不光含有家族所共有的“Sema”域，并擁有一特征性結構域“TSP-1”，即在胞膜外含有7個Ⅰ型血小板反應素(TSP-1)重復序列， Semaphorin 5A中的“Sema”域和“TSP-1”與腫瘤的發生發展有密切關系[10]。

本試驗采用免疫組化方法檢測了Semaphorin 5A在CMM瘤組織及黑素細胞痣中的表達情況，結果提示Semmaphorin 5A陽性表達主要定位于細胞質和(或)細胞膜，呈棕黃色、褐色。此結果支持Woodhouse等[1]的實驗結果。同時本研究也發現，Semaphorin 5A在CMM瘤組織中高表達，在黑素細胞痣中不表達或弱表達。采用Kendall′ tau-c相關性分析亦發現，Semaphorin 5A在CMM組織中的表達與腫瘤的惡性程度呈正相關，即侵襲深度越深，其表達越強。以上結果提示，Semaphorin 5A可能為CMM惡性程度相關的潛在標志物，并且可能具有促進CMM侵襲轉移的能力，但其具體作用機制如何仍有待進一步研究。本試驗的局限性在于樣本量較小，不排除存在誤差的可能。

[1] Woodhouse EC, Fisher A, Bandle RW, et al. Drosophila screening model for metastasis: Semaphorin 5c is required for l(2)gl cancerphenotype[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003,100(20):11463-11468.

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云南省科技廳-昆明醫科大學應用基礎研究聯合專項(2013FB138)。

劉彤云(E-mail:tongyyun91@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.020

R774

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1002-266X(2017)13-0065-03

2017-01-02)