TLR2、SIRT6、MMP-9在胎膜早破患者胎膜組織中的表達(dá)變化及其相關(guān)性

宋春紅，甄娟，楊蓉娟，畢學(xué)杰 (石家莊市第四醫(yī)院，石家莊050011)

TLR2、SIRT6、MMP-9在胎膜早破患者胎膜組織中的表達(dá)變化及其相關(guān)性

宋春紅，甄娟，楊蓉娟，畢學(xué)杰
(石家莊市第四醫(yī)院，石家莊050011)

目的 觀察胎膜早破(PROM)患者胎膜組織Toll樣受體2(TLR2)、沉默配型信息調(diào)節(jié)蛋白6(SIRT6)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表達(dá)變化，并探討三者間的相關(guān)性。方法 選擇足月胎膜早破(tPROM)患者20例(tPROM組)，未足月胎膜早破(pPROM)患者20例(pPROM組)，正常晚期妊娠婦女20例(正常對(duì)照組)，免疫組化法檢測(cè)各組胎膜組織TLR2、SIRT6與MMP-9表達(dá)部位，Western blotting法檢測(cè)各組胎膜組織TLR2、SIRT6與MMP-9蛋白表達(dá)水平，并分析三者的相關(guān)性。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，tPROM及pPROM組胎膜組織中TLR2及MMP-9的表達(dá)高(P均<0.01)，SIRT6的表達(dá)低(P<0.01)，三者在tPROM組與pPROM組的表達(dá)比較，P均>0.05。在胎膜組織中，TLR2與MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.64，P<0.05)，SIRT6與MMP-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.55,P<0.05)。結(jié)論 PROM患者中，TLR2及MMP-9表達(dá)水平升高、SIRT6表達(dá)水平降低，TLR2與MMP-9的表達(dá)正相關(guān)，SIRT6與MMP-9的表達(dá)負(fù)相關(guān)。

胎膜早破；基質(zhì)金屬蛋白酶9；沉默配型信息調(diào)節(jié)蛋白6；Toll樣受體2

胎膜早破(PROM)指胎膜在臨產(chǎn)前自發(fā)性破裂，嚴(yán)重影響母嬰健康。以妊娠是否滿37足周為界，可分為足月胎膜早破(tPROM)和未足月胎膜早破(pPROM)。宮內(nèi)感染是造成PROM的重要機(jī)制之一。Toll樣受體(TLR)家族屬于IL-1R/TLR超家族，與免疫炎癥相關(guān)。在天然免疫反應(yīng)中不僅可以清除病原體，而且可以通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)模式分子過(guò)程而激活獲得性免疫系統(tǒng)。沉默配型信息調(diào)節(jié)蛋白6(SIRT6)在維持基因組和端粒的穩(wěn)定性、調(diào)控炎性反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的激活在PROM中發(fā)揮了重要作用，MMP-9對(duì)胎膜細(xì)胞外基質(zhì)的異常降解是PROM發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。MMP-9的生成受自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)。在胎膜組織中，TLR2、SIRT6與MMP表達(dá)關(guān)系的研究較少。本研究檢測(cè)了TLR2、SIRT6及MMP-9在PROM患者胎膜組織中的表達(dá)，并探討了三者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1～12月因PROM在石家莊市第四醫(yī)院住院并以剖宮產(chǎn)結(jié)束妊娠婦女40例，患者均符合全國(guó)高等學(xué)校教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第7版[1]中胎膜早破的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中足月胎膜早破(tPROM組)20例，年齡(28.3±2.6)歲，孕周(38.5±2.9)周；未足月胎膜早破(pPROM組)20例，年齡(27.2±3.0)歲，孕周(31.3±2.7)周；選擇行剖宮產(chǎn)終止妊娠的正常晚期妊娠婦女20例為正常對(duì)照組，年齡(27.9±3.1)歲，孕周(38.1±2.6)周。各組無(wú)其他母體疾病、產(chǎn)科并發(fā)癥等，無(wú)吸煙、酗酒、吸毒等不良生活史，剖宮產(chǎn)指征為胎位異常、骨盆狹窄等。

1.2 標(biāo)本制備 胎盤娩出后，于無(wú)菌條件下取胎膜破口處胎膜組織5～10 g，其中一部分吸干水分后放入高壓滅菌處理的EP管中，投入液氮保存，備用；另一部分置于10%中性甲醛固定24～48 h后常規(guī)石蠟包埋、切片、烤片，切片厚度5 μm，進(jìn)行TLR2、SIRT6及MMP-9免疫組化染色，另外一張作為陰性對(duì)照。

1.3 胎膜組織中TLR2、SIRT6及MMP-9表達(dá)檢測(cè) ①免疫組化法檢測(cè)TLR2、SIRT6及MMP-9在胎膜組織中的表達(dá)部位。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化；檸檬酸緩沖液中微波加熱修復(fù)抗原，PBS沖洗；滴加3%過(guò)氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，室溫20 min，PBS沖洗；血清封閉室溫20 min；滴加一抗(TLR2 1∶300，SIRT6 1∶50，MMP-9 1∶300)，4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗；滴加試劑盒中增強(qiáng)劑，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗；滴加二抗，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗；蘇木素復(fù)染，水沖洗，鹽酸乙醇分化，1%氨水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，觀察與背景染色一致或無(wú)明顯著色為陰性。②Western blotting法檢測(cè)TLR2、SIRT6及MMP-9蛋白表達(dá)水平。提取胎膜勻漿蛋白，以BCA法定量后，將各組濃度調(diào)到同一水平，制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，每孔蛋白樣品60 μg，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，洗膜，加入一抗(TLR2 1∶900, SIRT6 1∶300, MMP-9 1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜。化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雜交蛋白表達(dá)，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。掃描圖像，進(jìn)行蛋白峰面積灰度分析，以β-actin為內(nèi)參照對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行蛋白半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 TLR2、SIRT6及MMP-9在PROM患者胎膜組織中的表達(dá)部位 免疫組化結(jié)果顯示，在胎膜組織，TLR2主要表達(dá)于羊膜細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞和絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞膜；MMP-9主要表達(dá)于羊膜細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞、絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞及中性粒細(xì)胞質(zhì)；SIRT6主要表達(dá)于羊膜細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞及絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞核。

2.2 TLR2、SIRT6及MMP-9在PROM患者胎膜組織中的表達(dá)水平 Western blotting結(jié)果顯示，tPROM組、pPROM組及正常對(duì)照組TLR2蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.98±0.15、1.05±0.17、0.54±0.11，MMP-9蛋白表達(dá)相對(duì)水平分別為1.28±0.16、1.31±0.19、0.97±0.22，SIRT6蛋白表達(dá)相對(duì)水平分別為0.60±0.14、0.57±0.14、0.96±0.20。tPROM及pPROM組胎膜組織中TLR2及MMP-9的表達(dá)高于正常對(duì)照組(P均<0.01)，tPROM組、pPROM組胎膜組織中TLR2及MMP-9表達(dá)水平相比，P均>0.05。tPROM及pPROM組胎膜組織中SIRT6表達(dá)水平低于正常對(duì)照組(P均<0.01)，tPROM組、pPROM組胎膜組織中SIRT6表達(dá)水平比較，P>0.05。

2.3 胎膜組織中TLR2、SIRT6及MMP-9表達(dá)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，在胎膜組織中，TLR2與MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.64，P<0.05)，SIRT6與MMP-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.55，P<0.05)。

3 討論

胎膜是胎兒的附屬物之一，由絨毛膜及羊膜組成。完整的胎膜能夠使羊膜腔內(nèi)保持一定的羊水量從而保護(hù)母胎安全，并可阻擋陰道病原微生物上行性感染，維持羊膜腔的無(wú)菌環(huán)境。PROM為產(chǎn)科常見并發(fā)癥，其發(fā)病是多因素、多途徑共同作用的結(jié)果。研究表明，感染與炎癥為PROM發(fā)生的主要原因[2,3]，且與PROM互為因果。慢性及急性炎癥可以導(dǎo)致自分泌和旁分泌失衡和細(xì)胞因子釋放，炎性因子和炎性抑制因子失衡導(dǎo)致胎膜脆性增加、宮頸成熟擴(kuò)張引起分娩。MMP對(duì)胎膜細(xì)胞外基質(zhì)的異常降解是PROM發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[4]。MMP表達(dá)調(diào)節(jié)有多種途徑，TLR2激活可以促進(jìn)炎性反應(yīng)，SIRT6有抗炎作用，本研究重點(diǎn)闡述了PROM患者胎膜組織中TLR2、SIRT6與MMP-9的表達(dá)及其相互關(guān)系。

胎膜含有豐富的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型膠原和蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能對(duì)維持羊膜的抗張性起著至關(guān)重要作用。MMP-9作為MMPs家族中重要的一員，以酶原的形式分泌，被激活后，形成Ⅳ型膠原酶，降解、破壞細(xì)胞外基質(zhì)的Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠[5]。MMP-9升高不僅見于正常分娩胎盤的羊膜，也見于早產(chǎn)患者的羊膜中。羊膜上皮細(xì)胞可產(chǎn)生MMP-9，在刺激因素作用下，MMP-9可以促進(jìn)基底膜降解，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及分離[6]。MMP-9表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，炎性細(xì)胞因子和內(nèi)毒素可以激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)[7,8]。本研究結(jié)果表明，MMP-9廣泛表達(dá)于胎膜羊膜上皮細(xì)胞、絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，在PROM患者，MMP-9表達(dá)升高，從而水解胎膜細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致胎膜脆性增加，發(fā)生PROM。

TLR2是與免疫及炎性反應(yīng)關(guān)系最為密切的TLR家族成員。TLR2位于細(xì)胞表面，屬Ⅰ型跨膜蛋白，包括富含亮氨酸重復(fù)序列的膜外區(qū)、跨膜區(qū)和含有Toll/IL-1R同源區(qū)結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)區(qū)。TLR2具有相對(duì)廣泛的配體特異性，包括細(xì)菌來(lái)源的外源性配體和宿主來(lái)源的內(nèi)源性配體，它能特異性識(shí)別革蘭陽(yáng)性菌成分，包括脂磷壁酸，與TLR1和TLR6協(xié)同構(gòu)成異源二聚體可以識(shí)別LPS。TLR2與胞外病原體相關(guān)分子模式或有害內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合被激活后，通過(guò)髓樣分化因子88依賴性途徑，激活MAPK及NF-κB途徑，導(dǎo)致前炎性細(xì)胞因子釋放。如前所述，炎性細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)MMP-9生成。在人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，TLR2被配體激活后，可以激活JNK和p38 MAPK，并可以誘導(dǎo)IκB-α降解和NF-κB核轉(zhuǎn)位，呈劑量依賴性誘導(dǎo)MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)。本研究表明，在PROM胎膜組織中，TLR2與MMP-9表達(dá)升高，兩者呈正相關(guān)，表明TLR2可能通過(guò)直接或間接作用促進(jìn)MMP-9表達(dá)。

SIRT6是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的組蛋白去乙酰化酶，與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的核心亞基RelA直接接觸，使RelA調(diào)控靶基因啟動(dòng)子部位的H3K9去乙酰化，以致RelA與染色質(zhì)結(jié)合不穩(wěn)定，最終終止NF-κB信號(hào)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，抑制靶基因表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。在子宮肌層、胎膜等組織中，NF-κB轉(zhuǎn)錄激活炎癥因子IL-6、IL-8、TNF及前列腺素過(guò)氧化物合成酶2，最終導(dǎo)致MMP-9和前列腺素產(chǎn)生，而后兩者是發(fā)動(dòng)分娩的重要因子。在羊膜細(xì)胞中，SIRT6過(guò)表達(dá)可以降低NF-κB活性，導(dǎo)致炎性分子和分娩啟動(dòng)因子轉(zhuǎn)錄降低。本試驗(yàn)研究顯示，在PROM組，SIRT6表達(dá)降低，MMP-9表達(dá)升高，兩者呈負(fù)相關(guān)，其可能機(jī)制為在PROM患者，SIRT6表達(dá)降低，對(duì)NF-κB的轉(zhuǎn)錄抑制功能降低，MMP-9表達(dá)升高。

綜上所述，在PROM胎膜組織中，TLR2與MMP-9表達(dá)升高，SIRT6表達(dá)水平降低；TLR2與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)，SIRT6與MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明炎性因子及炎性抑制因子失衡，從而導(dǎo)致MMP-9表達(dá)升高在PROM中發(fā)揮重要作用，為PROM的預(yù)防和治療提供了新的靶點(diǎn)；結(jié)合文獻(xiàn)，NF-κB可能是連接其中的關(guān)鍵分子，需要在細(xì)胞學(xué)中進(jìn)一步研究證實(shí)。

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