ELF5基因?qū)θ寺殉舶┘?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和大鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制

邱玲琳，閆洪超(徐州醫(yī)科大學(xué)研究生院,江蘇徐州 000；徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

ELF5基因?qū)θ寺殉舶┘?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和大鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制

邱玲琳1，閆洪超2
(1徐州醫(yī)科大學(xué)研究生院,江蘇徐州 221000；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 探討ELF5基因?qū)θ寺殉舶┘?xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和大鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用以及可能的機(jī)制。方法 體外實(shí)驗(yàn)：人卵巢癌細(xì)胞隨機(jī)分為重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、未經(jīng)轉(zhuǎn)染組，重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組分別轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核表達(dá)載體、空載質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP，未經(jīng)轉(zhuǎn)染組未經(jīng)任何轉(zhuǎn)染。Q-PCR法檢測(cè)各組ELF5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，Western blotting法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2及MMP- 9蛋白的相對(duì)表達(dá)量；Traswell試驗(yàn)評(píng)價(jià)ELF5對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。體內(nèi)試驗(yàn)：建立人卵巢癌NOD/SCID鼠左前肢腋下移植瘤模型，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組，即重組質(zhì)粒大鼠組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- ELF5+EGFP的人卵巢癌細(xì)胞)、空質(zhì)粒大鼠組(轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的人卵巢癌細(xì)胞)、未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的人卵巢癌細(xì)胞)，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞2×104/mL接種于NOD/SCID小鼠左前肢腋下。對(duì)比3組小鼠的移植瘤質(zhì)量和體積，計(jì)算各組小鼠腫瘤抑制率(首先對(duì)轉(zhuǎn)移瘤行HE染色進(jìn)行病理組織學(xué)檢查以確定其致瘤性)。Western blotting法檢測(cè)3組NOD/SCID小鼠移植瘤組織中MMP-2及MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果 人卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- ELF5+EGFP真核表達(dá)載體后，可穩(wěn)定表達(dá)，且于72 h后轉(zhuǎn)染率較高；與空質(zhì)粒組和未經(jīng)轉(zhuǎn)染組比較，重組質(zhì)粒組MMP-2及MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0．05)。Transell試驗(yàn)中，重組質(zhì)粒組穿膜細(xì)胞數(shù)少于空質(zhì)粒組及未經(jīng)轉(zhuǎn)染組(P均<0.05)。重組質(zhì)粒大鼠組抑瘤率達(dá)64.4%。重組質(zhì)粒大鼠組與其余兩組比較，其瘤組織中MMP-2及MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0．05)，而空質(zhì)粒大鼠組和未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組比較，P均>0.05。結(jié)論 ELF5基因可能通過(guò)抑制MMP-2及MMP-9的表達(dá)而降低卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

卵巢癌；ELF5基因；Ets轉(zhuǎn)錄因子家族;細(xì)胞轉(zhuǎn)染；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞轉(zhuǎn)移；移植瘤；大鼠

卵巢癌是一種高致死率疾病，且缺乏有效的早期篩查檢測(cè)方法。因此大多數(shù)患者被確診時(shí)已為晚期，5年生存率<40%[1]。卵巢癌早期診斷困難，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高，治療期間易對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗性，使其成為一種高病死率的疾病。深入研究并探討卵巢癌的生物學(xué)行為及其分子機(jī)制，為卵巢癌患者尋求更好的治療方案已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)換內(nèi)部和外部刺激，通過(guò)多信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)而影響基因表達(dá)變化的一類(lèi)細(xì)胞因子[2]。EIF5是Ets轉(zhuǎn)錄因子家族中具有上皮特異性的一個(gè)成員，也被稱(chēng)為ESE2,它位于人11號(hào)染色體短臂13～15區(qū)，這個(gè)區(qū)域在癌癥中易發(fā)生雜合性丟失[3]。該家族對(duì)細(xì)胞一系列正常生理過(guò)程，如分裂、分化、凋亡均有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)細(xì)胞腫瘤的發(fā)生皆與之相關(guān)。2015年2月～2016年8月，本課題組探討了ELF5基因轉(zhuǎn)染后對(duì)卵巢癌細(xì)胞的體外生物學(xué)行為，包括細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，同時(shí)探討了其對(duì)大鼠卵巢移植癌生長(zhǎng)的抑制作用，以探索ELF5基因作為卵巢癌基因治療靶向分子的潛能，并為卵巢癌的基因治療提供新的候選基因與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細(xì)胞株由本課題組篩選并保存。24只雌性NOD/SCID大鼠由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，鼠齡4～6周，體質(zhì)量18～25 g。實(shí)驗(yàn)室條件需要無(wú)特殊病原體，喂食大鼠水、飼料，以及鋪墊須經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的微生物控制。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，鼠抗MMP-2單克隆抗體、兔抗MMP-9單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，DMSO購(gòu)自Biosharp公司，細(xì)胞培養(yǎng)板、Matrigel和Transwell小室購(gòu)自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌細(xì)胞采用含有表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、Noggi及白血病抑制因子的無(wú)血清培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。期間視細(xì)胞狀態(tài)以決定是否換液，3～4 d后，待細(xì)胞達(dá)到約90%融合時(shí)，傳代以保持細(xì)胞良好狀態(tài)。

1.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ELF5基因的人卵巢癌細(xì)胞的構(gòu)建以及篩選 含有ELF5基因的pcDNA3.1- ELF5+EGFP真核細(xì)胞表達(dá)載體參照文獻(xiàn)[4]建立。轉(zhuǎn)染前1 d將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，每孔接種5×105個(gè)細(xì)胞，設(shè)未經(jīng)轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照。待細(xì)胞貼壁80%左右時(shí)用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-ELF5+EGFP真核細(xì)胞表達(dá)載體體外轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞(重組質(zhì)粒組)，同法將pcDNA3.1-EGFP轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞(空質(zhì)粒組)，轉(zhuǎn)染6 h后加入等體積含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞用含G418(350 ng/μL)的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，1周后細(xì)胞大部分死亡，消化存活的細(xì)胞并稀釋為1個(gè)/10 μL，轉(zhuǎn)移至96孔板中繼續(xù)加G418進(jìn)行培養(yǎng)，單個(gè)存活細(xì)胞增殖并形成克隆，經(jīng)RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證后擴(kuò)大培養(yǎng)。用于Transwell小室侵襲、遷移試驗(yàn)及Western blotting法檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞ELF5 mRNA 表達(dá)的檢測(cè) 采用Q-PCR法。上述各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，分別提取各組細(xì)胞總RNA，加入短片段引物進(jìn)行Q-PCR，通過(guò)內(nèi)標(biāo)基因GAPDH校正，所獲PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)各組細(xì)胞樣品ELF5基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。ELF5的PCR引物：F Primer：5′CCCATGCCATTGATGCTGA3′，R Primer：5′GGTGAGCTGCCACAGTTATTTGA3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s,然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。采用SYBR Green 1熒光染料嵌合法，通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增得到的cDNA片段, 熔解曲線分析，運(yùn)用2-ΔΔCT方法處理數(shù)據(jù)。

1.5 細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 采用Western blotting法。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72 h加人裂解液提取標(biāo)本蛋白,-20 ℃保存，測(cè)定蛋白濃度，制備分離膠與濃縮膠，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，將PVDF膜浸泡于50 g/L 脫脂牛奶,置搖床1.5 h后洗脫。一抗室溫孵育2 h，棄掉一抗，加入二抗，于室溫平緩搖動(dòng)2 h。TBST液洗脫P(yáng)VDF膜，掃描PVDF膜,放入暗盒進(jìn)行X線顯影，用Image J圖像軟件分析結(jié)果，與對(duì)應(yīng)β-actin的吸光度值之比作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 各組細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的檢測(cè) 采用Transwell侵襲遷移及劃痕試驗(yàn)。Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)：每個(gè)Transwell小室加入 Matrigel基質(zhì)膠50 μL(于實(shí)驗(yàn)前由-20 ℃冰箱轉(zhuǎn)置4 ℃冰箱過(guò)夜融化，經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)液按1∶5稀釋)，使其均勻包被Transwell小室基底膜，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱放置1～2 h，待基質(zhì)膠完全凝固。將各組細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸為單細(xì)胞懸液，以1×105/孔接種于鋪好基質(zhì)膠的Transwell小室中。上層為200 μL細(xì)胞懸液，下層為500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。顯微鏡下計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。重復(fù)3次，計(jì)算平均值。Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn):具體操作步驟同“Transwell侵襲”試驗(yàn)。Transwell遷移試驗(yàn)中，小室不需包被Matrigel基質(zhì)膠。將小室取出，PBS沖洗，用無(wú)菌棉棒輕輕拭去上室基底膜底面的細(xì)胞，95%甲醇固定，結(jié)晶紫染色，24 h后顯微鏡下計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。劃痕試驗(yàn)：3組細(xì)胞分別以同等濃度種植進(jìn)入6孔板，用經(jīng)滅菌100 μL槍頭垂直在培養(yǎng)板上垂直劃痕，用培養(yǎng)基緩緩洗兩遍，以洗去被劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。之后每隔12 h在相差顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍攝相差圖片，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)48 h，計(jì)算遷移到劃痕空隙的細(xì)胞總數(shù)，以此反映細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況，每組重復(fù)3次。

1.7 人卵巢癌NOD/SCID鼠移植瘤模型的建立及分組 將符合條件的24只裸鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，即重組質(zhì)粒大鼠組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- ELF5+EGFP的人卵巢癌細(xì)胞)、空質(zhì)粒大鼠組(轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的人卵巢癌細(xì)胞)、未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組(未經(jīng)轉(zhuǎn)染的人卵巢細(xì)胞)各8只，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞(2×104/mL),以0.5 mL/只接種于NOD/SCID小鼠左前肢腋下。大約于接種1周后，通過(guò)觀察每只小鼠左前肢腋窩有瘤樣腫物突起物，判斷瘤荷鼠模型建立是否成功,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未死亡NOD/SCID鼠納入結(jié)果分析。對(duì)比3組NOD/SCID小鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況，包括移植瘤的質(zhì)量和體積，腫瘤體積計(jì)算公式:V=ab2×π/6，a為長(zhǎng)徑，b為短徑，計(jì)算腫瘤抑制率[(1- 實(shí)驗(yàn)組瘤質(zhì)量/對(duì)照組瘤質(zhì)量)×100%]。

1.8 NOD/SCID鼠移植瘤體組織中MMP-2及MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 在大鼠接種第5周，待部分移植瘤體積接近1 000 mm3時(shí)，處死小鼠，取出每組NOD/SCID鼠的瘤體，首先經(jīng)病理組織學(xué)檢驗(yàn)以明確其致瘤性，后采用Western blotting法檢測(cè)MMP-2及MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1- ELF5+EGFP重組質(zhì)粒在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察，重組質(zhì)粒組和空質(zhì)粒組均可見(jiàn)到綠色熒光蛋白表達(dá)，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染組未見(jiàn)到綠色熒光，證明pcDNA3.1- ELF5+EGFP重組質(zhì)粒和pcDNA3.1-EGFP空質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞中且有表達(dá)。

2.2 各細(xì)胞組ELF5 mRNA表達(dá)比較 重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、未經(jīng)轉(zhuǎn)染組ELF5 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.97±0.69、1.00、1.00，重組質(zhì)粒組高于其他兩組(P均<0.05)；其他兩組間比較，P>0.05。

2.3 各細(xì)胞組卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力比較 將各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別接種于上室培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察顯示各組均有細(xì)胞通過(guò)Matrigel基質(zhì)膠的濾膜，重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、未經(jīng)轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(82.1±3.6)、(135.6±3.7)、(142.3±4.1)個(gè)/200倍視野。重組質(zhì)粒組與其他各組比較，穿膜細(xì)胞數(shù)減少(P均<0．01)，而其他兩組間比較，P>0．05。將各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于上室培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察各組均有細(xì)胞穿過(guò)濾膜，重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、未經(jīng)轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(93.2±2.5)、(150.6±4.3)、(149.4±5.1)個(gè)/200倍視野。重組質(zhì)粒組、未經(jīng)轉(zhuǎn)染組遷移出細(xì)胞數(shù)分別為(155.5±3.1)、(251.7±3.4)、(267.4±4.1)個(gè)/200倍視野，空質(zhì)粒組和未經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞組遷移細(xì)胞數(shù)均高于重組質(zhì)粒組(P均<0．01)，其兩組間比較，P>0．05。

2.4 各大鼠組裸鼠移植瘤及主要器官的病理形態(tài)學(xué)特征 首先各組大鼠移植瘤皆證實(shí)為卵巢癌，同時(shí)重組質(zhì)粒大鼠組在鏡下表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞大片壞死，部分細(xì)胞瓦解、碎裂，而空質(zhì)粒大鼠組和未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組腫瘤細(xì)胞壞死不明顯，多數(shù)表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞大小不一，形態(tài)各異，排列紊亂。

2.5 各大鼠組移植瘤質(zhì)量及體積比較 重組質(zhì)粒組移植瘤小且種植部位計(jì)數(shù)明顯低于空質(zhì)粒組和未經(jīng)轉(zhuǎn)染組；重組質(zhì)粒大鼠組抑瘤率達(dá)64.4%。重組質(zhì)粒大鼠組、空質(zhì)粒大鼠組、未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組移植瘤質(zhì)量分別為(0．28±0．16)、(0．86±0．17)、(0．91±0．19)g，重組質(zhì)粒大鼠組低于空質(zhì)粒大鼠組及未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組(P均<0．01)；空質(zhì)粒大鼠組及未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組比較，P>0．05。重組質(zhì)粒大鼠組接種2、3、4、5周移植瘤體積分別為(165.63±16.13)、(235.93±20.59)、(281.12±19.36)、(323.41±26.12)mm3，空質(zhì)粒大鼠組分別為(171.42±16.72)、(398.25±27.76)、(568.54±47.12)、(892.57±73.35)mm3，未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組分別為(189.72±17.32)、(423.34±31.12)、(618.85±49.03)、(921.67±85.34)mm3，重組質(zhì)粒大鼠組與其他兩組不同時(shí)間比較，P均<0．05；空質(zhì)粒大鼠組及未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組不同時(shí)間比較，P均>0．05。

2.6 各細(xì)胞組細(xì)胞中及各大鼠組移植瘤組織中的MMP-2及MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組及未經(jīng)轉(zhuǎn)染組中MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.45±0.02、1.47±0.07、1.23±0.03,MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.32±0.01、1.67±0.02、1.59±0.09,重組質(zhì)粒組MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空質(zhì)粒組及未經(jīng)轉(zhuǎn)染組(P均<0.05)，而空質(zhì)粒組及未經(jīng)轉(zhuǎn)染組比較，P>0．05。重組質(zhì)粒大鼠組、空質(zhì)粒大鼠組及未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組移植瘤組織中MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.42±0.03、0.98±0.03、1.00±0.09,MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.27±0.02、0.95±0.02、1.00±0.08,重組質(zhì)粒大鼠組移植瘤組織中MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空質(zhì)粒大鼠組及未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組(P均<0.05)，而空質(zhì)粒大鼠組及未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組比較，P均>0．05。

3 討論

最近，有專(zhuān)家提出腫瘤干細(xì)胞是癌癥復(fù)發(fā)的原因[5]。傳統(tǒng)的化療甚至能殺死大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，但對(duì)腫瘤干細(xì)胞卻無(wú)法起到靶向治療作用，原因就在于腫瘤干細(xì)胞區(qū)別于成熟、已分化的細(xì)胞，其一是能對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗性。因?yàn)槟[瘤干細(xì)胞和其他正常干細(xì)胞一樣，且有著更能抵抗DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的生存優(yōu)勢(shì)，以維護(hù)基因組完整性[6]。這表明，初步治療增加了腫瘤干細(xì)胞耐藥的比例，因其能產(chǎn)生獲得性化療耐藥，因而不可避免地出現(xiàn)復(fù)發(fā)。因此，定義卵巢癌干細(xì)胞和識(shí)別其調(diào)控分子，聯(lián)合治療靶向清除腫瘤干細(xì)胞是有效治療卵巢癌的關(guān)鍵。本課題組在前期研究中以人卵巢癌細(xì)胞株HO8910細(xì)胞為研究對(duì)象，篩選出具有“癌干細(xì)胞”特性的CD133+CD117+細(xì)胞，并對(duì)其相關(guān)的干細(xì)胞“特性”進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定，結(jié)果表明，本課題組所提取出的“癌干細(xì)胞”體內(nèi)成瘤能力顯著，自我更新和分化能力明顯，并具有多藥耐藥等腫瘤干細(xì)胞的特征[7]。而就目前分離鑒定卵巢癌干細(xì)胞所依據(jù)的標(biāo)志物以及方法仍存在較多的爭(zhēng)議,因此我們對(duì)分離出的“癌干細(xì)胞”尚均稱(chēng)為卵巢癌細(xì)胞。

近十年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞或者腫瘤起始細(xì)胞的起源尚不明確，但一些具有腫瘤異質(zhì)性的細(xì)胞群落已經(jīng)在許多惡性腫瘤中被證實(shí)存在，并猜測(cè)其可能為腫瘤組織細(xì)胞克隆的核心，具無(wú)限增殖、自我更新和多向分化、高致瘤性和抵抗放化療的能力，而這些都是腫瘤干細(xì)胞的一些特性[8]。脫離原發(fā)灶侵襲鄰近組織和遠(yuǎn)處廣泛轉(zhuǎn)移是造成卵巢癌患者高病死率的首要原因，因此，如何限制卵巢癌的侵略性行為是當(dāng)前有效提高卵巢癌治療效果的重要攻克目標(biāo)。

Ets家族成員對(duì)于細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育及凋亡等正常的生理活動(dòng)都具有非常重要的調(diào)節(jié)作用，而ELF5 屬于Ets家族成員[2]。目前對(duì)ELF5的研究主要集中在乳腺細(xì)胞、乳腺癌及移行細(xì)胞癌等方面。ELF5不僅對(duì)腺泡細(xì)胞的增殖、發(fā)育起影響，與其胚胎發(fā)育進(jìn)程亦有一定聯(lián)系[8]。在乳腺癌的研究中證實(shí)，ELF5是一個(gè)潛在的腫瘤抑制因子,可對(duì)癌細(xì)胞起抑制作用，并能抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[9]。本試驗(yàn)中，人卵巢癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染ELF5基因后，其表現(xiàn)出的生物學(xué)特性，侵襲、轉(zhuǎn)移以及體內(nèi)成瘤能力，相對(duì)于其他兩組都明顯下降，因此推論，在卵巢癌中ELF5基因在其侵襲、轉(zhuǎn)移中同樣能起到抑制作用，同時(shí)體外侵襲、轉(zhuǎn)移能力是體現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的重要指標(biāo)。

腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落、突破組織屏障是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。原發(fā)腫瘤形成后，脫落、黏附、降解、移動(dòng)和轉(zhuǎn)移形成貫穿于惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的全過(guò)程[10]。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM )和基膜是腫瘤浸潤(rùn)、擴(kuò)散過(guò)程中的一道天然屏障。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一組降解ECM的鋅離子依賴(lài)內(nèi)肽酶,在腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要作用。目前, 已確定的MMPs 有26 種,MMP-9是MMPs中明膠酶的一種,能夠降解ECM 中的Ⅳ型膠原[11],從而參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，Ⅳ型膠原是ECM和基膜的重要組成成分。腫瘤細(xì)胞分泌的MMPs中,MMP-2、MMP-9 可降解Ⅳ型膠原,在腫瘤的血管化、腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移灶形成過(guò)程中起重要作用，從而參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移[12～15]。研究表明，較正常組織和良性病變，MMP-2和MMP-9在最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤的表達(dá)顯著增加(如：宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌)。本研究中，我們?cè)趯?duì)卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行靶向ELF5 基因轉(zhuǎn)染后使其表達(dá)，結(jié)果顯示，ELF5基因上調(diào)后，卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力降低，MMP-2 和MMP-9蛋白表達(dá)明顯下降，在動(dòng)物試驗(yàn)中也表現(xiàn)出同樣趨勢(shì)的結(jié)果;另外，重組質(zhì)粒大鼠組相對(duì)于空質(zhì)粒大鼠組及未經(jīng)轉(zhuǎn)染大鼠組移植瘤的生長(zhǎng)受到明顯抑制，且從病理切片表現(xiàn)看，重組質(zhì)粒大鼠組移植瘤體中腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)壞死數(shù)量多，細(xì)胞核溶解、固縮明顯。推測(cè)ELF5基因有抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移的作用，此作用可能是通過(guò)抑制MMP-2 和MMP-9的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。雖然具體調(diào)控機(jī)制及三者如何相互作用來(lái)影響侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探討，但可以期待ELF5有潛力作為卵巢癌基因治療的靶向分子，并為卵巢癌的基因治療提供新的候選基因與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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閆洪超(E-mail:1015058194@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.013

R737.31

A

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2016-10-29)