高原低氧條件下大鼠鐵代謝及其相關因子表達的變化

鄭蓓,耿惠,李雙,劉立,孫朝君,劉玉潔(青海大學，西寧8000；青海大學附屬醫院；滄州市人民醫院；淄礦集團中心醫院)

高原低氧條件下大鼠鐵代謝及其相關因子表達的變化

鄭蓓1,耿惠2,李雙1,劉立1,孫朝君3,劉玉潔4
(1青海大學，西寧810001；2青海大學附屬醫院；3滄州市人民醫院；4淄礦集團中心醫院)

目的 探討高原低氧條件下大鼠鐵代謝及其相關因子表達變化。方法 選取雄性SD大鼠50只，將大鼠分別在低氧環境[低壓氧艙(模擬海拔5 000 m)飼養]下飼養7、15、30 d(低氧7 d、15 d、30 d組),常氧條件下[西寧地區(海拔2 260 m)飼養]飼養7、15、30 d(常氧7 d、15 d、30 d組)。分別于飼養7、15、30 d測定大鼠外周血血常規、血清鐵(SI)、血清鐵蛋白(SF)水平，qRT-PCR 和Western blotting法測大鼠肝組織鐵調素(Hepc)、膜結合型鐵調素調節蛋白(m-HJV)、Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(TMPRSS6)及肌肉組織可溶型鐵調素調節蛋白(s-HJV)mRNA和蛋白表達量，qRT-PCR和ELISA法測大鼠肝臟Hepc mRNA和蛋白表達量。結果 低氧7 d、15 d、30 d組大鼠血紅蛋白(Hb)、紅細胞壓積(HCT)、SF水平均高于常氧同時間組(P均<0.01)，低氧30 d組 SI水平高于常氧同時間組(P<0.05)，隨著缺氧時間延長Hb、HCT、SI、SF水平逐漸升高(P均<0.05)。低氧15 d、30 d組肝組織Hepc mRNA及蛋白表達量均低于常氧同時間組(P<0.01或<0.05)，且隨著缺氧時間延長其表達水平逐漸降低(P均<0.01)。低氧各組間組大鼠肝組織m-HJV mRNA及蛋白表達量均低于常氧同時間組(P均<0.01)，隨缺氧時間延長m-HJV逐漸降低(P均<0.01)。低氧各時間組大鼠肌肉組織s-HJV mRNA及蛋白表達量、肝組織TMPRSS6 mRNA及蛋白表達量均高于常氧同時間組(P均<0.01)，且隨著缺氧時間延長表達量逐漸升高(P均<0.01)。結論 高原低氧條件下，大鼠肝組織TMPRSS6表達量升高，可能裂解m-HJV成為s-HJV，使Hepc轉錄受抑制，最終導致SI水平升高。

鐵代謝；鐵調素；鐵調素調節蛋白；Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶；低氧；大鼠

鐵調素(Hepc)是由肝細胞生成的小分子多肽，促進鐵輸出蛋白膜鐵轉運蛋白(FPN)的內化和降解，通過限制膳食鐵的吸收和巨噬細胞儲存鐵的釋放調節鐵平衡[1]。Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(TMPRSS6)和鐵調素調節蛋白(HJV)是目前已知的在調控Hepc中發揮重要作用的兩個上游調節基因。TMPRSS6是一種主要在肝臟表達的新型嵌合酶，于2002年首次被識別。TMPRSS6可下調Hepc的表達，且以此方式增加血清鐵(SI)水平。TMPRSS6在低氧條件下被上調，這給低氧和鐵穩態提供了新的聯系[2]。HJV是由位于1q21的染色體HJV基因編碼產生的，在肝臟、骨骼肌和心臟高度表達，在細胞內鐵的吸收和釋放方面有重要作用[3]。HJV是骨形態發生蛋白(BMP)受體的共受體，通過Smad信號通路調節Hepc的表達[4]。HJV在哺乳動物中以膜結合和可溶性形式存在，膜結合型HJV(m-HJV)主要在肝臟表達，可溶型HJV(s-HJV)主要在骨骼肌及血清中發現，且m-HJV和s-HJV對Hepc的調節是競爭性抑制的。國內外有研究認為在高原低氧狀況存在Hepc調節的改變，尚無具體Hepc調節改變的機制研究。2015年10月～2017年1月，本課題組通過模擬高原不同暴露時間，探討低氧狀態下大鼠SI、血清鐵蛋白(SF)，肝組織Hepc、m-HJV、TMPRSS6及肌肉組織s-HJV表達的變化，以進一步揭示慢性高原病(CMS)鐵代謝發生變化的相關機制，為CMS的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：雄性健康SD大鼠50只，體質量180～200 g，由西安交通大學第一附屬醫院動物所提供，動物合格證號：scxk(陜)2012-003。TRIzol RNA提取試劑購于美國Invitrogen公司，TIANGEN Script RT 試劑盒及Super Real PreMix Plus(SYBR Green)購于Tiangen公司。Hepc、m-HJV、TMPRSS6、s-HJV引物購于美國Invitrogen公司，SI及SF試劑由西門子公司提供。Hepc ELISA試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物處理和實驗分組 選取50只健康雄性SD大鼠，從西安運到西寧，適應1周后進行實驗。將大鼠隨機分為低氧組和常氧組，西寧地區(海拔2 260 m)飼養7、15、30 d各8只(常氧7 d、15 d、30 d組)，低壓氧艙(模擬海拔5 000 m)飼養7 d 8只、15 d 9只及30 d 9只(低氧7 d、15 d、30 d組)，兩組動物飼養環境基本一致。分別于飼養7、15、30 d收集外周血及肝臟、肌肉標本備檢。

1.3 血常規及血清SI、SF的檢測 腹腔注射20%烏拉坦(1 mL/200 g體質量)麻醉大鼠，腹主動脈取血行血常規檢測；另取全血提取血清后放于EP管中，加封口膜，保存于-80 ℃冰箱，用比色法測SI及免疫發光法測SF。

1.4 肝組織m-HJV、TMPRSS6及肌肉組織s-HJV蛋白表達量的測定 采用Western blotting法。麻醉大鼠后，處死，并取遠離肝血管竇部肝組織及大鼠腓腸肌長頭組織，迅速放入液氮罐中待測。稱取50 mg肝臟/肌組織，按照1∶10的比例加入RIPA蛋白裂解液，置于冰上，充分研磨至組織完全裂解，將研磨皿底部液體吸至1.5 mL EP管內，裂解30 min；4 ℃、14 000 r/min離心20 min，收集上清液，即為總蛋白。取少量上清進行蛋白定量，其余部分加入Loading Buffer液，104 ℃煮30 min，后置于-20 ℃保存備用。再經制膠、上樣、電泳、轉膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯色，曝光采集圖像。目的蛋白相對表達量為目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值。

1.5 肝組織Hepc蛋白表達量的檢測 采用ELISA法。取待測肝組織50 mg,嚴格按照試劑盒說明書步驟進行試驗操作,酶標儀測量各孔OD值，繪制標準曲線，根據標準曲線的方程計算待測樣本的表達量，乘上稀釋倍數，即可算出待測樣本實際的表達量。

1.6 肝組織Hepc、m-HJV、TMPRSS6及肌肉組織s-HJV mRNA表達測定 采用qRT-PCR 法。將50 mg肝臟/肌肉織迅速放入已加入1 mL TRIzol的EP管中，行勻漿處理(持續勻漿不超過10 s),室溫靜置5 min，再經過離心、各相分離、RNA沉淀、RNA漂洗、無水乙醇沉淀及RNA溶解，測定RNA濃度和RNA質量，用紫外分光光度儀測定OD比值(A260/A280)。瓊脂糖凝膠電泳跑膠、紫外線下觀察條帶并成像。基因引物堿基序列：hepcidin上游引物：5′-GCCTGTCTCCTGCTTCTC-3′，下游引物：5′-TCTGTCTCGTCTGTTGCC-3′;HJV上游引物：5′-GTCCTCTTTGTTCTGTGGTTT-3′，下游引物：5′-GGTCGTTGTCTCCTGTCC-3′;TMPRSS6上游引物：5′-CTTCACTTCCAACCCTTT-3′，下游引物：5′-TTACTTTCCCACAGACCTT-3′;β-Actin上游引物：5′-CCTAGAACTTCGAGCAAGAGA-3′，下游引物：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGA-3′。試驗在ABI7500熒光實時定量PCR儀上進行，每個樣品設3個重復孔，每組樣品重復1次。PCR反應條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個循環，用ABI7500軟件采集并分析數據。基因相對表達量運用2-ΔΔCt法計算。

2 結果

2.1 各組血清血紅蛋白(Hb)、紅細胞壓積(HCT)及SI、SF水平比較 低氧7 d、15 d、30 d組血清Hb分別為(205.38±9.18)、(231.67±11.37)、(259.67±12.13) g/L，血清HCT分別為66.69%±3.51%、68.74%±2.96%、76.36%±3.68%，SI分別為(35.18±8.60)、(41.37±8.82)、(41.67±9.77)μmol/L，SF分別為(78.9±18.85)、(88.10±29.49)、(97.13±40.70)μg/L；常氧7 d、15 d、30 d組分別為(169.88±6.83)、(175.25±4.65)、(188.75±6.20) g/L，54.04%±1.74%、51.46%±1.15%、54.84%±1.81%，(31.29±4.23)、(39.48±6.95)、(38.91±6.32)μmol/L，(31.58±11.4)、(47.01±7.56)、(60.40±15.27)μg/L。低氧7 d、15 d、30 d組大鼠血清Hb、HCT及SF水平均高于常氧同時間組(P均<0.01)，低氧30 d組 SI水平高于常氧同時間組(P<0.05)，隨著缺氧時間延長Hb、HCT、SI、SF水平逐漸升高(P均<0.05)。

2.2 大鼠肝組織Hepc、TMPRSS6、m-HJV蛋白及肌肉組織s-HJV 蛋白表達量比較 低氧7 d、15 d、30 d組肝組織Hepc蛋白表達量分別為6.341±0.609、5.713±0.469、5.387±0.699，肝組織TMPRSS6分別為1.25±0.18、2.63±0.23、3.95±0.50，肝組織m-HJV分別為0.81±0.08、0.32±0.04、0.17±0.02，肌肉組織s-HJV分別為1.50±0.16、2.90±0.26、5.10±0.40；常氧7 d、15 d、30 d組分別為7.363±1.352、7.145±1.342、6.627±1.323，1.03±0.10、1.06±0.11、0.97±0.09，1.06±0.14、0.98±0.10、1.10±0.13，1.05±0.08、1.10±0.10、0.97±0.09。低氧15 d、30 d組肝組織Hepc蛋白表達量低于常氧同時間組(P均<0.05)； 各低氧組肌肉組織s-HJV、肝組織TMPRSS6蛋白表達量高于常氧同時間組(P均<0.01)，肝組織m-HJV蛋白表達量低于常氧同時間組(P均<0.01)；隨缺氧時間延長s-HJV、TMPRSS6表達量逐漸升高，m-HJV表達量逐漸降低(P均<0.01)。

2.3 大鼠肝組織Hepc、m-HJV、TMPRSS6及肌肉s-HJV mRNA表達量的比較 低氧7 d、15 d、30 d組肝組織Hepc mRNA表達量分別為1.42±0.61、0.85±0.25、0.54±0.38，肝組織TMPRSS6 mRNA分別為1.61±0.39、1.79±0.31、2.48±0.59，肝組織m-HJV mRNA分別為1.55±0.32、1.14±0.40、0.79±0.20，肌肉組織s-HJV mRNA分別為1.65±0.49、2.03±0.62、2.19±0.54；常氧7 d、15 d、30 d組分別為1.81±0.46、1.75±0.56、1.50±0.42，1.05±0.15、1.07±0.16、1.18±0.29，1.94±0.66、1.75±0.34、1.8±0.29，1.00±0.33、1.13±0.14、1.20±0.31。低氧各時間組肌肉組織s-HJV、肝組織TMPRSS6 mRNA表達量比常氧同時間組升高(P均<0.01)，隨缺氧時間延長s-HJV、TMPRSS6 mRNA表達量逐漸升高(P均<0.01)；低氧15 d、30 d組肝組織Hepc、m-HJV mRNA表達量比常氧同時間組降低(P均<0.01)，隨缺氧時間延長Hepc、m-HJV mRNA表達量逐漸降低(P均<0.01)。

3 討論

CMS是高原地區一種常見病，其主要特征是紅細胞過度生成和血液黏稠度提高[5]，常合并心腦血管疾病、缺血缺氧性腎病、肺栓塞等多種致死率較高的疾病，嚴重威脅高原人群的身體健康。已有研究證明，大鼠在低壓低氧狀態下呈現出Hepc水平的降低，這種低氧刺激部分是由于紅細胞生成的增多導致鐵利用增加，而紅細胞生成增多是由低氧刺激促紅細胞生成素所致。Hepc控制系統性鐵穩態可應對不同的刺激，如機體總鐵含量的變化、紅細胞生成的增多、缺氧和炎癥反應[6]。平原地區人進入高海拔地區，血清Hepc表達將受抑制，反映出紅細胞生成鐵需求增加，但在此情況下，Hepc受抑制的機制和原始刺激并不清楚。Talbot等[7]發現紅細胞生成活動的激活，而不是缺氧本身，是高原地區抑制Hepc表達的主要刺激。

研究顯示，HJV通過骨形成蛋白(BMP)/Smad信號通路調控Hepc基因轉錄發揮重要作用，體內實驗分析得出，s-HJV抑制Hepc表達[8,9]。以25 mg/kg體質量的劑量在小鼠腹腔內注射重組s-HJV,每周3次，連續3周，導致Hepc表達受抑制，FPN的表達增加和動員來自網狀內皮系統細胞的儲存鐵。外源s-HJV活動可使SI水平增加[8]。Babitt等[9]的試驗證明了s-HJV和m-HJV共同調節Hepc的表達，以應對細胞外鐵濃度的改變。HJV是目前惟一被識別的鐵調節蛋白。低氧誘導TMPRSS6表達，TMPRSS6可裂解細胞膜表面的m-HJV，因此m-HJV表達下降。HJV除了被TMPRSS6裂解外，還被與反式高爾基區有關的弗林蛋白酶裂解。在低氧狀況下，弗林蛋白酶上調，由過缺氧誘導因子通路介導的弗林蛋白的轉錄調控導致s-HJV水平升高。在體外，TMPRSS6通過裂解m-HJV,使其作為BMP信號通路共受體的功能受抑制。因此，TMPRSS6可能直接參與BMP信號通路，其酶活性對缺鐵的反應和Hepc合成的下調是必需的。

本研究結果顯示，低氧組TMPRSS6、s-HJV蛋白和mRNA表達量較常氧組明顯升高，且隨缺氧時間延長其表達量逐漸升高；低氧組m-HJV蛋白和mRNA水平較常氧組明顯下降，且隨缺氧時間延長其表達量逐漸下降；低氧組Hepc蛋白和mRNA表達量較常氧組明顯下降，且隨缺氧時間延長其表達量逐漸下降。提示高原低氧刺激TMPRSS6表達量增高，TMPRSS6進而結合和裂解m-HJV成為s-HJV，進一步抑制Hepc的表達,最終導致SI升高，這可能是Hepc在CMS中的重要調節機制。

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青海省科技廳應用基礎研究計劃基金資助項目(2014-ZJ-720)。

耿惠(E-mail：gh0227@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.011

R74.4

A

1002-266X(2017)13-0039-03

2016-12-02)