miR-24對人臍靜脈內皮細胞增殖、轉移及自噬的影響

楊鵬，羅雪蘭，莫國君，陶曉靜，沈鳳，歐和生( 廣西醫科大學藥學院，南寧530021)

miR-24對人臍靜脈內皮細胞增殖、轉移及自噬的影響

楊鵬，羅雪蘭，莫國君，陶曉靜，沈鳳，歐和生
( 廣西醫科大學藥學院，南寧530021)

目的 探討miR-24對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)增殖、轉移、自噬的影響。方法 將HUVECs隨機分為空白對照組、雷帕霉素+miR-24高表達組、雷帕霉素組。空白對照組不給予任何處理；雷帕霉素組的HUVECs用1 000 nmol/L雷帕霉素處理6 h建立自噬模型。雷帕霉素+miR-24高表達組的HUVECs先轉染miR-24高表達質粒，待轉染成功后以同樣方法建立自噬模型；用CCK-8法檢測HUVECs增殖能力，細胞劃痕試驗檢驗細胞的轉移能力，進一步用免疫組織化學和 Western blotting 法檢測HUVECs自噬蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)和Beclin-1的蛋白表達水平，采用透射電鏡觀察細胞內部自噬小體。結果 與空白對照組相比，雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達組OD值、細胞遷移比例降低、Beclin-1蛋白及LC3Ⅱ蛋白表達量上升(P<0.01或<0.05)。與雷帕霉素組相比，雷帕霉素+miR-24高表達組OD值、細胞遷移比例下降，Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白表達量下降(P<0.01或<0.05)。透射電鏡觀察結果顯示，空白對照組和雷帕霉素+miR-24高表達組的細胞質內各細胞器分布基本正常，細胞核形態也正常，細胞質中未見明顯自噬小體；雷帕霉素組細胞質中可見明顯的空泡狀結構、包含部分雙層膜結構的自噬小體。結論 miR-24可顯著抑制HUVECs的增殖、轉移及自噬。

人臍靜脈內皮細胞；miRNA-24；細胞自噬；細胞增殖

miRNAs是一類高度保守的內源性非編碼單鏈小分子RNA，長19～22個核苷酸，其通過作用于靶基因的3′UTR區域來調控靶基因mRNA降解或翻譯，是一種在轉錄后水平對基因進行調控的方式[1]。在血管內皮細胞特異性表達的miRNAs,通過參與血管內皮細胞分化、增殖、遷移、成管與凋亡等調控血管新生的過程，且這些miRNAs的表達異常在血管新生及相關疾病的發生、發展中發揮著重要作用[2，3]。內皮細胞自噬與血管疾病的生理病理過程有高度相關性。Nishikawa等[4]研究發現，通過誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)自噬，能促進血管內皮細胞增殖，從而促進血管新生。研究發現,一些miRNAs可以通過調控與自噬相關的微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)和Beclin-1蛋白的表達，從而發揮對自噬的調節作用[5，6]。最新研究表明，miR-24能顯著抑制血管內皮細胞增殖[7]，然而，miR-24在抑制血管內皮細胞增殖的過程中是否涉及對自噬水平的調控鮮有文獻報道。2015年7月～2016年7月，本研究探討了miR-24在抑制血管內皮細胞增殖的過程中對細胞自噬水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVECs(Procell，中國武漢)；1640細胞培養基(Gibco，上海立菲生物技術有限公司)；胎牛血清(Gibco，澳洲)；載體miRNASelectTMpEGP-miR(Cell Biolabs)；X-tremeGENE HP DNA 轉染試劑盒(Roche，德國 )；人工基底膜 (Matrigel)(Corning，美國)；質粒提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；內參β-actin抗體(廣州晶欣生物科技有限公司)；LC3,HIF-1α,BNIP3和 Beclin1抗體(Cell Signaling，美國)；蛋白電泳儀、蛋白質轉膜儀(Bio-Rad，美國)；Odyssey紅外熒光掃描成像系統(LICOR，美國)；透射電子顯微鏡(日立 H7650，日本)。

1.2 miR-24高表達質粒的構建及鑒定 miR-24序列(來自http://www.miRbase.org)為 5′-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3′;首先通過DNA合成技術得到第1 鏈DNA，然后再利用DNA 連接反應合成相應的雙鏈 DNA，通過PCR擴增后和體外重組，最后插入 pEGP-miR 載體轉化入E.coli DH 5α感受態宿主菌，選取經酶切初步證實并插入正確的單克隆菌落，然后提取質粒DNA寄往上海生工測定 DNA 序列。

1.3 HUVECs的培養和轉染 HUVECs用含有100 mg/L鏈霉素、1×105U/L青霉素、10%胎牛血清的1640培養基培養，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中。提取的質粒用NANO核酸測定儀測定濃度，重復3次，取平均值。然后使用無血清 1640 培養基將質粒稀釋至濃度為0.01 μg/μL，并將 X-tremeGENE HP DNA 轉染試劑與質粒按3 μL∶1 μg比例混合，取生長正常的 HUVECs 孵育，24 h 后更換含10%胎牛血清1640培養基，培養24 h觀察免疫熒光。

1.4 細胞分組以及HUVECs自噬模型的建立 將實驗細胞隨機分為3組：空白對照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達組。空白對照組不給于任何處理；雷帕霉素組建立自噬模型。雷帕霉素+miR-24高表達組的HUVECs待miR-24高表達質粒轉染成功后，建立自噬模型。根據文獻[8]實驗步驟，采用HUVECs經1 000 nmol/L雷帕霉素處理6 h建立自噬模型。

1.5 HUVECs增殖活力的檢測 采用CCK-8法。96孔板每孔加入細胞密度為5×103/mL細胞懸液100 μL，每組設置3個復孔，在37 ℃、5% CO2培養箱內培養24 h使其貼壁，各組細胞按設定條件處理后，每孔加入CCK-8試劑10 μL,培養箱避光孵育1 h，用酶標儀檢測450 nm波長處光密度(OD)值，試驗重復3次。

1.6 HUVECs轉移能力的檢測 采用細胞劃痕試驗。取對數生長期HUVECs配制成單細胞懸液，調整細胞密度為每孔5×104/mL，接種于24孔板，待細胞貼壁、生長成單細胞層時，用200 μL槍頭于板孔底面中軸劃“一”道劃痕，用PBS洗滌3次，然后加入無血清1640培養基繼續培養。分別于0 h和24 h顯微鏡下觀察細胞遷移情況并測量劃痕寬度，遷移比例 =(劃痕 0 h 后劃痕寬度-劃痕 24 h 后劃痕寬度)/ 劃痕 0 h 后劃痕寬度，實驗重復 3 次。

1.7 HUVECs內自噬小體的觀察 利用透射電鏡法。將固定液存放于4 ℃冰箱；將各組實驗細胞分別消化，然后分別用15 mL離心管離心(800 r/min，5 min)；倒掉上清，加PBS 1 mL到離心管中，混懸；然后把混懸液吸入一個潔凈的EP管中，低溫離心(約5 000 r/min，15 min)，棄上清，加入固定液1 mL，送電鏡室觀察。

1.8 HUVECs內Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白表達的檢測 ①采用免疫組化法檢測。將無菌玻片放入24孔板，加入細胞(每孔2×104個HUVECs)培養24 h，轉染并造模成功后取爬片，PBS沖洗3次，中性樹脂粘片，4%甲醛固定。用TritonX-100(10 min)和3%過氧化氫(30 min)處理后雙蒸水沖洗3次，敷Ⅰ抗、Ⅱ抗后顯色劑顯色。Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白表達于胞質，Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白的表達以棕黃色作為陽性判斷標準。②采用Western blotting 法檢測。將各組細胞裂解，12 000 r/min、4 ℃離心 15 min，取上清。各實驗組分別取蛋白 30 μg進行 SDS-PAGE(8%)分離并轉至PVDF膜上，然后加入Beclin-1和LC3Ⅰ抗孵育過夜(4 ℃) 。TBST沖洗3次(每次15 min)，加入Ⅱ抗孵育，1 h后重復用TBST避光沖洗(方法同上)。利用LICOR公司的Odyssey紅外熒光掃描成像系統分析蛋白電泳條帶的灰度值，計算Beclin-1 和 LC3Ⅱ蛋白的表達量。以β-actin為內參，Beclin-1或LC3Ⅱ的相對表達量=Beclin-1或LC3Ⅱ灰度值/β-actin灰度值。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組HUVECs的增殖活力比較 空白對照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達組的OD值分別為1.28±0.03、0.87±0.01、0.47±0.01，與空白對照組相比，雷帕霉素+miR-24高表達組OD值降低63.45%(P<0.01),雷帕霉素組OD值降低32.62%(P<0.01)。與雷帕霉素組相比，雷帕霉素+miR-24高表達組OD值降低45.96%(P<0.01)。

2.2 各組HUVECs的轉移情況 空白對照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達組HUVECs的遷移比例分別為0.33±0.40、0.18±0.15、0.09±0.32，與空白對照組比較，劃痕24 h后雷帕霉素+miR-24高表達組HUVECs的遷移比例降低72.72%(P<0.05)，雷帕霉素組的遷移比例降低45.46%(P<0.05)。與雷帕霉素組相比，雷帕霉素+miR-24高表達組HUVEC的遷移比例下降了50.00%(P<0.05)。

2.3 各組HUVECs的超微結構 透射電鏡觀察結果顯示，空白對照組和雷帕霉素+miR-24高表達組的細胞質內各細胞器分布基本正常，細胞核形態也正常，細胞質中未見明顯自噬小體；雷帕霉素組細胞質中可見明顯的空泡狀結構、包含部分雙層膜結構的自噬小體。

2.4 各組HUVECs Beclin-1蛋白表達比較 Beclin-1蛋白表達量以雷帕霉素組最高，雷帕霉素+miR-24高表達組的表達較少，而對照組則基本沒有表達。空白對照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達組Beclin-1蛋白表達分別為0.03±0.02、0.26±0.01、0.09±0.01，與空白對照組比較，雷帕霉素組的Beclin-1蛋白表達量上升了766.67%(P<0.05)，雷帕霉素+miR-24高表達組上升了200.00%(P<0.05)；與雷帕霉素組比較，雷帕霉素+miR-24高表達組下降了65.38%(P<0.05)。

2.5 各組HUVECs LC3Ⅱ蛋白表達比較 雷帕霉素組LC3 Ⅱ蛋白表達量最高，雷帕霉素+miR-24高表達組的表達較少，而空白對照組基本沒有表達。空白對照組、雷帕霉素組、雷帕霉素+miR-24高表達組LC3 Ⅱ蛋白表達量分別為0.05±0.01、0.48±0.01、0.15±0.02，與空白對照組比較，雷帕霉素組LC3 Ⅱ蛋白表達量上調了860.00%(P<0.05)；雷帕霉素+miR-24高表達組上調了200.00%(P<0.05)；與雷帕霉素組比較，雷帕霉素+miR-24高表達組蛋白表達量下調了68.75%(P<0.05)。

3 討論

miRNAs是一類長19～22 nt的內源性單鏈小分子非編碼RNA，近年越來越多的證據顯示，miRNA在細胞分化、增殖、遷移和凋亡等過程中起著關鍵作用。miRNA在眾多人類疾病，如血管疾病和癌癥以及糖尿病等疾病的發生發展過程中發揮著重要作用[8]。例如，miR-126在內皮細胞中特異性表達，并參與內皮細胞生物合成、血管發育及維持血管完整性等生理過程[9]。

自噬普遍存在于絕大多數真核生物中，細胞自噬是一種利用溶酶體對自身受損蛋白質和細胞器進行降解，從而為細胞提供能量和原料來維持自身代謝平衡的高度保守的細胞降解過程。當細胞處于氧化應激或輻射等環境中時，自噬可能會被誘發，一定程度的自噬對細胞具有保護作用[10]；但是，當自噬不足或自噬過度則會使細胞內環境穩態失調從而損傷細胞，甚至導致細胞死亡[11]。許多心血管疾病的發生發展都與細胞自噬程度的變化有關。例如在心力衰竭過程中，適度的自噬對心肌細胞有保護作用，而過度自噬則會導致心肌細胞死亡，并可能會使心力衰竭進一步惡化[12]。近年研究發現，有些miRNAs通過調控自噬相關基因表達，參與自噬過程的調節，在心血管疾病發生發展過程中發揮重要作用。Jian等[13]發現，心肌細胞在缺氧復氧情況下誘發自噬時，miR-204可以通過下調LC3Ⅱ抑制自噬的進程，進而保護心肌細胞，使其免于缺氧復氧造成的損傷。Small等[14]發現，在小鼠缺血再灌注心肌中，miRNA-30表達量明顯減少。自噬相關基因Beclin-1是miRNA-30的直接作用靶點，通過上調細胞自噬水平可影響內源性miRNA-30表達。因此，miRNA-30是通過下調Beclin-1表達，進而抑制自噬形成。

血管內皮細胞是機體內的一種重要細胞，血管內皮細胞增殖與眾多心血管疾病的生理病理過程密切相關[15，16]。研究表明，miRNA的特異性改變參與了心血管疾病的發生發展進程。因此，miRNA是否對血管內皮細胞的自噬水平有調節作用，以及是否對血管內皮細胞的生理功能產生影響，是一個重要的研究課題。本研究通過透射電鏡觀察發現，經雷帕霉素處理后，HUVECs 胞質中可見明顯的自噬小體，與文獻[17]中描述的自噬體結構一致，而經miR-24+雷帕霉素處理的HUVECs 胞質中并未發現明顯的自噬小體結構。LC3Ⅱ和Beclin-1是自噬的相關基因，參與了自噬小體的形成，且細胞中LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達量與自噬發生的程度密切相關。本試驗免疫組化和Western blotting結果顯示，經雷帕霉素處理的HUVECs，與空白對照組相比，細胞中LC3 Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達量均增多，而雷帕霉素+miR-24高表達組的HUVECs內LC3Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達量明顯少于雷帕霉素組，提示miR-24可抑制自噬相關基因LC3Ⅱ和Beclin-1的表達。同時CCK-8法和劃痕試驗結果表明，miR-24能顯著抑制HUVECs的增殖。提示miR-24有可能是通過抑制LC3 Ⅱ和Beclin-1基因的表達，進而降低HUVECs的自噬水平，最終導致HUVECs的增殖受到抑制。但是血管內皮細胞增殖的過程受多種因素調節，其機制不僅僅是受單一分子或基因所調控，所以其具體的分子機制仍不清楚，有待進一步研究。

本文通過研究miR-24對自噬相關基因LC3Ⅱ和Beclin-1的表達及血管內皮細胞增殖的影響，主要有以下發現：第一，miR-24對調控LC3Ⅱ蛋白和Beclin-1蛋白的表達具有明顯的調節作用；第二，miR-24抑制LC3 Ⅱ和Beclin-1表達的同時，也抑制血管內皮細胞的增殖、轉移；第三，miR-24很有可能是通過調控LC3Ⅱ和Beclin-1表達，進而抑制血管內皮細胞增殖、轉移。

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Effects of miR-24 on cell proliferation, metastasis and autophagy of HUVECs

YANGPeng,LUOXuelan,MOGuojun,TAOXiaojingSHENFeng,OUHesheng

(CollegeofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effects of miR-24 on the cell proliferation, metastasis and autophagy of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Methods HUVECs were randomly divided into the blank control group, rapamycin + miR-24 high expression group and rapamycin group. The control group was not treated. HUVECs in the rapamycin group were treated with 1000 nmol/L rapamycin for 6 h to establish an autophagic model. HUVECs in the rapamycin + miR-24 high expression group were transfected with miR-24 high expression plasmid. After successful transfection, the cells were treated with 1 000 nmol/L rapamycin for 6 h to establish the autophagic models. The proliferation ability of HUVECs was detected by CCK-8, and the cell migration ability was measured by cell scratch test, the protein expression levels of microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) and Beclin-1 in HUVECs were detected by immunohistochemistry and Western blotting. The autophagic bodies were observed by transmission electron microscopy.Results Compared with the blank control group, the OD value and migration ratio of the rapamycin group and the rapamycin + miR-24 high expression group were decreased and the expression of Beclin-1 protein and LC3 II protein was increased (P<0.01 orP<0.05). Compared with the rapamycin group, the OD value and migration ratio of the rapamycin + miR-24 high expression group were decreased, and the expression of Beclin-1 and LC3 II protein was decreased (P<0.01 orP<0.05). The results of transmission electron microscopy showed that the distribution of each organelle in the cytoplasm of the blank control group and the rapamycin + miR-24 high expression group was normal, the nucleus morphology was normal and the autophagic bodies were not found in the cytoplasm. In the the rapamycin group, the obvious vacuolar structure and the autophagosome containing part of the bilayer structure conld be seen in the cytoplasm.Conclusion miR-24 significantly inhibits the proliferation, metastasis and autophagy of HUVECs.

human umbilical vein endothelial cells; miRNA-24; cell autophagy; cell proliferation

國家自然科學基金資助項目( 81373403)。

楊鵬(1991-),男，碩士研究生，主要研究方向為心血管分子藥理學。E-mail:475394354@qq.com

歐和生(1965-),男，博士生導師，主要研究方向為心血管分子藥理學。E-mail:hsou01@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.007

R34

A

1002-266X(2017)13-0024-04

2017-02-13)