血漿EGFR基因突變檢測在晚期非小細胞肺癌患者EGFR-TKI療效評估中的價值

馮衛能,張華,陳澤程,唐溢聰,梁劍苗,鄧燕明(廣東省佛山市第一人民醫院，廣東佛山528000)

血漿EGFR基因突變檢測在晚期非小細胞肺癌患者EGFR-TKI療效評估中的價值

馮衛能,張華,陳澤程,唐溢聰,梁劍苗,鄧燕明
(廣東省佛山市第一人民醫院，廣東佛山528000)

目的 探討血漿表皮生長因子受體(EGFR)突變狀態檢測在晚期非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKI)療效評估中的價值。方法 應用擴增阻滯突變系統(ARMS)法檢測70例晚期非小細胞肺癌患者腫瘤組織及血漿的EGFR突變狀態。以腫瘤組織中的EGFR突變狀態檢測為對照，計算血漿中EGFR突變狀態檢測的敏感性、特異性、一致性，并比較兩種檢測對患者EGFR-TKI療效及預后評估的差異。結果 以配對的腫瘤組織EGFR突變檢測結果為對照，ARMS法檢測血漿EGFR突變的敏感性、一致性及特異性分別為58.1%、72.9%、96.3%。在38例經過EGFR-TKI治療的患者中，腫瘤組織EGFR突變型患者的有效率及中位無進展生存期均優于EGFR野生型患者(有效率：69% 比11.1%，P=0.005；無進展生存期：10個月比3個月，P=0.003)。血漿EGFR突變型患者與腫瘤組織EGFR突變型患者的有效率及中位無進展生存期均相似(有效率：P=0.908；中位無進展生存期：P=0.593)。在血漿標本中，EGFR突變型患者的中位無進展生存期長于EGFR野生型患者(10個月比7個月 ，P=0.032)。EGFR突變型患者的有效率高于EGFR野生型患者，但差異無統計學意義(70.6%比42.9%，P=0.111)。 結論 血漿EGFR突變可預測晚期非小細胞肺癌患者EGFR-TKI療效，但因較高的假陰性率，血漿EGFR野生型患者需應用腫瘤組織進一步檢測。

非小細胞肺癌；擴增阻滯突變系統；表皮生長因子受體；循環腫瘤DNA

肺癌是世界范圍最常見的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占80%，超過65%的NSCLC在診斷時已屬晚期[1]。表皮生長因子受體酪氨酸酶抑制劑(EGFR-TKI)是目前治療晚期NSCLC主要方法。研究顯示，EGFR基因突變狀態是EGFR-TKI療效的重要預測因子， EGFR突變檢測是合理應用EGFR-TKI的先決條件[2]。檢測EGFR突變首選應用腫瘤組織，但晚期NSCLC腫瘤組織獲取往往比較困難而限制進行EGFR突變檢測。近年應用患者血液循環腫瘤DNA(ctDNA)進行腫瘤基因分型的“液體活檢”方法受到關注，“液體活檢”為非侵入性檢查，可以避免組織標本量少的問題，有利于提高臨床實踐中EGFR基因突變的檢測率[3]。ARMS法是一種高度敏感的檢測腫瘤組織EGFR突變方法，本研究通過檢測晚期NSCLC患者配對的腫瘤組織和血漿標本的EGFR突變狀態，探討ARMS法檢測血漿EGFR突變在患者EGFR-TKI療效評估中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇本院2011年6月～2013年6月收治的晚期NSCLC患者70例， 均經組織學確診。按2009年國際抗癌聯盟(UICC)肺癌TNM分期均為Ⅳ期。患者男29例，女41例；年齡38～78歲、中位年齡62歲；腺癌63例，鱗癌7例；行為狀態評分(PS)0～1分 54例，PS 2分16例；吸煙20例，不吸煙50例。其中一線接受EGFR-TKI治療13例，二線或二線以上接受EGFR-TKI治療25例。

1.2 治療方法 EGFR-TKI治療方法：吉非替尼 250 mg ，1次/d或厄洛替尼 150 mg ，1次/d，持續服用直至病情進展或毒性不可耐受。療效評估：近期療效按照實體腫瘤的療效評價標準1.1版[4]分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩定(SD)和疾病進展(PD)，獲得CR或PR的患者4周后再確認療效。有效率=(CR+PR)病例數/總病例數。遠期療效為無進展生存期(PFS)。PFS定義為從EGFR-TKI治療開始至疾病進展或任何原因導致死亡的時間。EGFR-TKI治療結束后每8周隨訪一次，末次隨訪時間為2016年6月30日。

1.3 血漿及組織EGFR基因突變檢測 收集患者治療前外周靜脈血4 mL，室溫放置2 h后于4 ℃低溫高速離心機離心10 min(3 000 r/min)，取上層液血漿1 mL置入2 mL凍存試管放置-80 ℃冰箱保存。組織標本來自本院病理科石蠟包埋組織標本。DNA提取:依據操作說明，應用DNeasy血液和組織試劑盒(Qiagen，德國)從5～20 mg腫瘤組織或1 mL血漿中提取DNA。應用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，美國)測定DNA濃度 。采用人類EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)(廈門艾德生物醫藥科技有限公司，中國),按照試劑盒說明書進行操作，檢測患者組織及血漿第18～21外顯子最常見的29種體細胞突變。按照試劑盒說明書結果判定方法，EGFR突變陽性判斷標準為：①循環閾值(Ct)<26；②26≤Ct<29，同時符合ΔCt值(突變Ct-外控Ct)≤11(19-del 突變、L858R 突變)或ΔCt值≤7(G719X 突變)或ΔCt值≤8(S768I 突變、L861Q突變)。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。配對腫瘤組織與血漿中EGFR突變狀態的一致性采用Kappa檢驗。EGFR基因突變狀態與EGFR-TKI有效率的關系采用χ2檢驗及Fisher′s精確檢驗。EGFR突變狀態與PFS的關系采用Kaplan-Meier法分析，Log-rank檢驗差異性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 晚期NSCLC患者血漿與腫瘤組織中EGFR基因突變狀態比較 在70例患者配對的腫瘤組織及血漿中，腫瘤組織EGFR基因突變發生率為61.4%(43/70)，其中19del突變占46.5%(20/43)、L858R突變占44.2%(19/43)、L861Q突變占4.7%(2/43)、G719X突變占2.3%(1/43)、S768I突變占2.3%(1/43)。血漿EGFR基因突變發生率為37.1%(26/70)，其中19del突變占46.2%(12/26)、L858R突變占42.3%(11/26)、L861Q突變占7.7%(2/26)、S768I突變占3.8%(1/26)。腫瘤組織與血漿檢測EGFR基因突變的一致性為72.9%(51/70)(κ=0.487，P<0.01)。與腫瘤組織檢測EGFR突變相比，血漿檢測EGFR突變的敏感性為58.1%(25/43)、特異性為96.3%(26/27)。

2.2 血漿與腫瘤組織EGFR突變型與野生型晚期NSCLC患者EGFR-TKI有效率比較 腫瘤組織EGFR突變型與野生型患者EGFR-TKI治療的有效率分別為69%(20/29)、11.1%(1/9)，兩者比較，P=0.005。血漿EGFR突變型與野生型患者EGFR-TKI有效率分別為70.6%(12/17)、42.9%(9/21)，兩者比較，P=0.111。血漿與腫瘤組織EGFR突變型患者的有效率比較，P=0.908。

2.3 血漿與腫瘤組織EGFR突變型與野生型晚期NSCLC患者PFS比較 腫瘤組織中EGFR突變型及野生型患者的中位PFS分別為10、3個月，兩者比較，P=0.003。血漿EGFR突變型、野生型患者的PFS分別為12、7個月，兩者比較，P=0.032。腫瘤組織EGFR突變型患者與血漿EGFR突變型患者的中位PFS比較，P=0.593。

3 討論

EGFR突變檢測是合理應用EGFR-TKI治療晚期NSCLC的先決條件，腫瘤組織是EGFR突變檢測優先選擇的生物材料[2]。但晚期NSCLC組織標本主要為肺穿刺或支氣管鏡活檢的小標本，31%晚期NSCLC患者因為標本量不足而不能實施基因檢測[5]。而且，腫瘤異質性會導致活檢的小標本不能準確反映腫瘤整體的基因改變[6]。由于應用腫瘤組織進行基因檢測存在不足，以血液為生物材料進行基因檢測的“液體活檢”成為一種重要的新方法，ctDNA是“液體活檢”最重要的檢測材料之一。

目前，國內檢測晚期NSCLC腫瘤組織EGFR基因突變最常用的方法是直接測序法和ARMS法。相比直接測序法，ARMS法具有更高的靈敏性及陰性預測價值[7]。對于ARMS法檢測腫瘤組織EGFR突變型的患者，EGFR-TKI的有效率為60%～80%，中位PFS為8～10個月，明顯優于EGFR野生型患者[7]。本研究結果與上述報告相似。

近年來，ARMS法也被應用于檢測晚期非小細胞肺癌ctDNA的EGFR突變。Goto等[8]用ARMS法檢測86例晚期NSCLC血漿標本EGFR突變，與配對的腫瘤組織標本相比，其敏感性、一致性分別為43.1%，100%、 66.3%。另有研究發現,ARMS法檢測晚期NSCLC血漿EGFR突變的敏感性、特異性、一致性分別為48.2%、95.4%、73.6%。本研究結果與文獻報道相似，敏感性、特異性、一致性分別為58.1%、96.3%、72.9%。提示ARMS法檢測ctDNA的EGFR突變具有高特異性，但靈敏性仍不理想，假陰性率較高(40%～50%)，如果檢測結果為EGFR野生型，需注意排除假陰性可能。此外，本研究中有1例患者腫瘤組織檢測為EGFR野生型，而ctDNA檢測為EGFR突變型，可能與腫瘤異質性有關[6]。

至今，關于ARMS法檢測血漿EGFR突變狀態與EGFR-TKI療效關系的研究仍然較少。Li等分析結果顯示，對于ARMS法檢測血漿EGFR突變型的晚期NSCLC患者，EGFR-TKI的有效率及PFS分別為68.4%、7.9個月。而血漿EGFR野生型患者的有效率及PFS分別為38.9%、6.1個月。有研究報告血漿EGFR突變型晚期NSCLC患者的PFS為10.88個月，而血漿EGFR野生型患者的PFS為9.89個月。在本研究中，血漿EGFR突變型患者的有效率及PFS與腫瘤組織EGFR突變型患者相近，PFS明顯長于野生型患者。但由于存在假陰性，對于血漿EGFR野生型患者，EGFR-TKI的有效率仍然高達42.9%，PFS長達7個月，明顯優于基于腫瘤組織檢測EGFR野生型患者的療效[7]。本研究結果與既往報告相似，顯示ARMS法檢測血漿EGFR突變陽性可預測EGFR-TKI治療晚期NSCLC患者的有效率及PFS,但在血漿EGFR野生型患者中不能預測EGFR-TKI療效。

本研究存在一些不足之處，為回顧性研究，樣本量小，未能對不同的EGFR突變類型(19del突變、L858R突變、L861Q突變、G719X突變、S768I突變等)分別進行分析。研究結果顯示不同EGFR突變類型對EGFR-TKI的療效存在差異，不分EGFR突變類型分析可能影響研究結果的準確性。

總之，本研究顯示ARMS法檢測血漿EGFR突變狀態可預測EGFR-TKI療效。但ARMS法檢測血漿EGFR突變具有較高的假陰性率，如檢測結果為EGFR野生型，需應用腫瘤組織檢測進一步確認。

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Predictive value of EGFR mutation detection in plasma for the EGFR-TKI efficacy in advanced non-small-cell lung cancer patients

FENGWeineng,ZHANGHua,CHENZecheng,TANGYicong,LIANGJianmiao,DENGYanming

(TheFirstPeople'sHospitalofFoshan,Foshan528000,China)

Objective To investigate the predictive value of epidermal growth factor receptor (EGFR) mutation detection in plasma for the EGFR tyrosine kinase inhibitor (EGFR-TKI) efficacy in advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients. Methods EGFR mutations in the tumor tissues and matched plasma samples from 70 advanced NSCLC patients were assessed using amplification refractory mutation system (ARMS). The sensitivity, specificity and consistency of EGFR mutations in plasma were calculated by taking the EGFR mutations in tumor tissues as the control group. The differences of EGFR-TKI efficacy and prognosis were compared between the two detections.Results Compared with the EGFR mutation detection in the matched tumor tissues, the sensitivity, consistency and specificity of EGFR mutations in plasma detected by ARMS was 58.1%, 72.9% and 96.3%, respectively. For the 38 patients treated with EGFR-TKI, the response rate (ORR) and median progression-free survival (PFS) was significantly superior in the EGFR mutant group as compared with the wild-type group in tumor tissue samples (ORR: 69% vs. 11.1%,P=0.005; PFS: 10 months vs. 3 months,P=0.003). ORR and PFS of patients with EGFR mutation in plasma was consistent to that of patients with EGFR mutation in tumor tissues (ORR:P=0.908; PFS:P=0.593). In the plasma samples, PFS of patients with EGFR mutations was longer than that without EGFR mutations (10 months vs 7 months,P=0.032). Patients with EGFR mutations had significantly higher ORR than those without mutations (70.6% vs 42.9%,P=0.111). Conclusions The detection of EGFR mutations in plasma can predict the efficacy of EGFR-TKI. However, due to the high false negative rate in plasma samples, for the patients with wild-type EGFR in plasma, they need further confirmation in tumor tissues.

non-small-cell lung cancer; amplification refractory mutation system;epidermal growth factor receptor; circulating tumor DNA

廣東省科技計劃項目(20120318077)；佛山市科技創新專項基金(2014AG10003)；佛山市醫學類科技攻關項目(2014AB00307)。

馮衛能(1972-)，男，副主任醫師，主要研究方向為肺癌多學科綜合治療和肺癌轉化性研究。E-mail:fengweineng@163.com

鄧燕明(1962-)，女，主任醫師，主要研究方向為肺癌多學科綜合治療和肺癌轉化性研究。E-mail:yanmingdeng78@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.005

R734.2

A

1002-266X(2017)13-0017-03

2017-01-18)