NOX介導的氧化應激對肝纖維化相關信號通路調控的研究進展

張望，朱萱

(南昌大學第一附屬醫院，南昌330006)

NOX介導的氧化應激對肝纖維化相關信號通路調控的研究進展

張望，朱萱

(南昌大學第一附屬醫院，南昌330006)

肝纖維化是各種慢性肝臟疾病的共同病理結果，以細胞外基質尤其是Ⅰ型和Ⅲ型膠原的過度沉積為主要特點，其持續進展可導致肝硬化，甚至肝癌。NADPH氧化酶(NOX)是一種多亞基組成的跨膜酶復合物，眾多研究表明其介導的氧化應激在肝纖維化的發病機制中發揮重要作用，并參與調控多條肝纖維化相關信號通路，如TGF-β/Smad信號通路、MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路、NF-κB信號通路。

NADPH氧化酶；氧化應激；肝纖維化；信號通路

肝纖維化是肝臟對各種慢性損傷刺激發生修復反應的共同病理結果[1]， 其以細胞外基質(ECM)尤其是Ⅰ型和Ⅲ型膠原的過度沉積為主要特點，肌成纖維細胞是肝纖維化發生時ECM的主要來源，肝纖維化的持續進展可演變為肝硬化，甚至肝癌。目前國內外大量研究表明肝星狀細胞(HSCs)活化、增殖為肝纖維化發生的中心事件。眾多因素(如肝細胞凋亡、細胞因子刺激等)可導致HSCs活化，活化的HSCs形態和功能發生一系列改變，轉變為肌成纖維細胞，導致ECM大量分泌，從而引起肝纖維化的發生。越來越多的研究表明氧化應激與HSCs的活化、肝纖維化的發生密切相關，而NADPH氧化酶(NOX)作為目前唯一已知的專職產生活性氧簇(ROS)的酶類，其介導的氧化應激在肝纖維化發病中起重要作用，抑制NOX介導的氧化應激能明顯減少HSCs活化，抑制肝纖維化發生。現就NOX介導的氧化應激對肝纖維化相關信號通路調控的研究進展作一綜述。

1 NOX介導的氧化應激概述

氧化應激是指機體反應活性氧簇(ROS)的產生與抗氧化防御系統(酶性抗氧化劑和非酶性抗氧化劑)之間的平衡被打破，機體ROS過度產生，內源性抗氧化防御系統功能減退，從而引起機體組織細胞發生損傷[2]。ROS種類繁多，包括超陰離子、過氧化氫、羥自由基和單線態氧等，在生理狀態下，ROS作為正常代謝產物具有多種生物學功能，對正常細胞的增殖、分化和凋亡均有重要作用，但在病理狀態下，ROS過量產生則會導致氧化應激，其可通過多種機制損傷細胞的結構和功能，如直接氧化細胞組分，導致脂質過氧化或激活細胞內氧化還原信號通路，促進細胞凋亡等，參與多種疾病(自身免疫性疾病、癌癥和纖維化等)的發生[3]。在肝臟中，ROS具有多種來源，包括線粒體呼吸鏈、細胞色素P450單加氧酶、黃嘌呤氧化酶、微粒體、過氧化物酶體和NOX[4]。NOX是由多亞基組成的跨膜酶復合物，是目前惟一已知的專職產生ROS的酶類[5]，其最早發現于吞噬細胞中，后來研究表明NOX在多種組織細胞中均有表達。迄今為止，人類已發現7種NOX成員：NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2，他們共同組成NOX家族。在NOX家族中，吞噬細胞型NOX2是目前研究最為清楚的成員，吞噬細胞型NOX由細胞膜上的催化亞基NOX2(gp91phox)、調節亞基P22phox和胞質調節亞基P47phox、P40phox、P67phox、Rac1、Rac2組成，其中NOX2和P22phox在細胞膜上形成異二聚體-黃素細胞色素b558復合物，當NOX受到各種刺激因素作用時，亞基P47phox被磷酸化，隨后胞質調節亞基移位至胞膜同黃素細胞色素b558復合物相互作用，導致NOX活化，活化的NOX以NADPH為電子傳遞體將電子傳遞給氧分子，從而產生ROS[3,6]。非吞噬細胞型NOX(NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2)的結構與吞噬細胞型NOX類似，但在亞基組成和酶活化方面存在一定差異，如NOX1的組裝與活化需NOXO1亞基(P47phox的同系物)和NOXA1亞基(P67phox的同系物)參與[7]，而NOX4的活化則僅需胞質調節亞基P22phox的募集[8]。NOX表達于多種組織細胞中，其中肝臟既有吞噬細胞型NOX表達，亦有非吞噬細胞型NOX表達，Paik等[9]研究表明在CCl4和膽管結扎誘導的實驗性肝纖維化小鼠模型中，肝臟NOX1和NOX2表達上調，而NOX1和NOX2缺失后，肝纖維化程度、HSCs的活化數量和肝臟脂質過氧化程度則明顯減輕，AngⅡ誘導的HSCs ROS產生亦明顯減少。Lan等[10]研究發現在肝硬化患者中，肝臟NOX1和NOX4蛋白水平明顯增加，但在NOX1和NOX4基因敲除的CCl4誘導肝纖維化的小鼠中，肝臟的炎癥、氧化應激和纖維化程度下降，同時，NOX1/NOX4雙重抑制劑GKT137831可阻斷LPS、PDGF和Hedgehog(Hh)配體Shh誘導的HSCs ROS產生。

2 NOX介導的氧化應激參與調控肝纖維化TGF-β/Smad信號通路

TGF-β超家族是由諸多有共同生物學特征的蛋白信號分子組成，其包括TGF-β亞族、激活素亞族、抑制素亞族、骨形態形成蛋白亞族(BMPs)和生長分化因子(GDFs)等，參與細胞生長分化、腫瘤發生和損傷修復等多種生物學效應[11]。TGF-β亞族由TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3構成，TGF-β因子以無活性的前體形式分泌，經TGF-β激活激酶活化后而發揮作用，活化的TGF-β首先與細胞膜表面的TGF-β受體結合形成受體異聚體復合體，隨后受體異聚體復合體活化下游信號轉導分子Smad2/3，活化的Smad2/3與Co-smad(Smad4)結合成多聚體移位至胞核，進而調節相關靶基因的轉錄表達。TGF-β亞族以Smad依賴途徑參與多種纖維化疾病的發生，其中TGF-β1與肝纖維化的發生密切相關[12]。Zhang等[13]研究表明在CCl4誘導纖維化大鼠的肝臟中，P-Smad2和P-Smad3表達上調，Smad3過表達能明顯增加TGF-β1誘導的HSCs膠原分泌和TIMP-1表達，而Smad2則可抑制TGF-β1/Smad3介導的HSCs膠原沉積而發揮抗纖維化作用。TGF-β通過Smad依賴途徑活化HSCs，同時伴隨HSCs NOX4亞基表達上調，而敲除NOX4則可抑制TGF-β誘導的HSCs活化，但敲除NOX4并不抑制TGF-β及其受體的表達，亦不改變Smad2/3的磷酸化水平，表明在HSCs中，NOX4為TGF-β/Smad信號通路的下游信號分子[14,15]。同時，在TGF-β誘導肝細胞凋亡過程中，沉默NOX4、應用抗氧化劑或NOX抑制劑DPI可阻斷TGF-β誘導的肝細胞ROS產生和Caspase-3活化，抑制肝纖維化進展[14]。

3 NOX介導的氧化應激參與調控肝纖維化MAPK信號通路

MAPK是一類廣泛存在于真核細胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，其可被一系列胞外刺激(細胞因子、生長因子和氧化應激等)激活，活化的MAPK移位至胞核從而調節靶基因的轉錄表達。MAPK家族主要包括4個亞族：細胞外信號調節蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38和大絲裂素活化蛋白激酶1(BMK-1)。MAPK的激活是細胞內磷酸化級聯反應的結果，經典的MAPK級聯反應包括三個細胞內蛋白激酶的序貫激活：首先胞外刺激通過各種機制激活MAPK激酶激酶(MAP3K)，隨后活化的MAP3K磷酸化激活MAPK激酶(MAP2K)，最后，活化的MAP2K再次以磷酸化方式激活MAPK。MAPK家族的4個亞族由不同的胞外刺激活化，從而形成不同的MAPK信號通路，介導不同的生物學效應，其中ERK通路主要由生長因子、激素和促炎因子激活，而JNK通路和p38通路主要由細胞應激激活[16]。MAPK信號通路與多種纖維化疾病的發病機制密切相關，在肝纖維化的發病機制中，多種促纖維化因素可通過NOX源性的ROS調控MAPK信號通路。PDGF為HSCs最強有力的促有絲分裂劑，其可活化并上調HSCs NOX組分，促進ROS產生，ROS可進一步活化ERK和p38信號途徑，促進HSCs增殖，應用NOX抑制劑DPI、抗氧化劑NAC或CGA則可抑制ERK與p38的活化和HSCs增殖[17,18]。Leptin是一種主要由脂肪細胞分泌的調節機體能量代謝的激素，其亦是重要的促肝纖維化因子，在原代培養的HSCs中，Leptin活化NOX，介導氧化應激形成和ERK1/2磷酸化，進而活化轉錄因子Sp1/Sp3同Ⅰ型膠原啟動子的調控元件結合，促進Ⅰ型膠原分泌[19]。

4 NOX介導的氧化應激參與調控肝纖維化PI3K-AKT信號通路

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是一類能特異性催化磷脂酰肌醇(PI)肌醇環第3位羥基磷酸化的蛋白激酶，根據其結構、分布和活化機制可分為三類：classⅠ、classⅡ和class Ⅲ，目前研究最多的為classⅠPI3K。PI3K是由調節亞基p85和催化亞基p110組成的異源二聚體，PI3K活化后，其催化亞基將細胞膜上的PtdIns(4,5)P2(PIP2)轉化為PtdIns(3,4,5)P3(PIP3)，PIP3作為第二信使進一步激活下游蛋白。AKT是PI3K下游信號通路的關鍵靶蛋白之一，目前已知的AKT家族由三個結構相似的亞型組成：AKT1(PKBα)、AKT2(PKBβ)和AKT3(PKBγ)，其結構中均含有PH結構域、激酶催化結構域和調控結構域三個功能區，PIP3與AKT的PH結構域相互作用，在膜上募集AKT并改變其構型，隨后3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)磷酸化AKT，活化的AKT移位至胞漿或胞核，通過對一系列底物蛋白磷酸化進而調控細胞應答[20]。PI3K-AKT信號通路與多種疾病的發病機制密切相關，NOX介導的氧化應激與PI3K-AKT信號通路間的交互調控影響多種疾病的進展。在肝纖維化的發病機制中，Cui等[21]研究表明在膽管結扎誘導肝纖維化的小鼠中，NOX1源性的ROS和失活的PTEN可正性調節AKT/FOXO4/p27(Kip1)信號通路，促進HSCs增殖和纖維化發生。最近Wu 等[22]研究表明HCV核心蛋白能通過NOX源性的ROS活化PI3K-AKT信號通路，進而抑制過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)的表達，促進HSCs活化和膠原沉積。He等[23]研究亦發現在HSCs中，熊果酸可通過抑制HSCs中NOX介導的氧化應激阻斷leptin誘導的PI3K-AKT等多條信號通路的活化，進而發揮抗纖維化作用。

5 NOX介導的氧化應激參與調控肝纖維化NF-κB信號通路

NF-κB轉錄因子家族是一類廣泛存在于真核細胞中的具有轉錄激活功能的蛋白質，其包括5位成員，分別為RelA(P65)、RelB、NF-κB1(P50/P105)、NF-κB2(P52/P100)和c-Rel，其中P105和P100分別為P50和P52的前體蛋白，在蛋白酶體作用下可形成P50和P52亞基。NF-κB轉錄因子家族在結構上均含有Rel同源區,該同源區包括二聚體化部位、IκB結合位點和DNA結合部位，其分別介導形成NF-κB二聚體、NF-κB與IκB蛋白的相互作用和NF-κB與DNA結合。NF-κB以同源二聚體或異源二聚體形式存在于胞質中，在靜息狀體下，NF-κB與抑制蛋白IκB在胞質中結合，無轉錄活性，當外來刺激活化IκB蛋白激酶(IKK)后，IKK磷酸化IκB蛋白并使其被蛋白酶降解，NF-κB與IκB分離并移位至胞核，進而調節多種基因的轉錄[24]。在肝纖維化的發病機制中，NOX介導的氧化應激可通過NF-κB信號通路介導肝臟炎癥，促進纖維化發生。在華支睪吸蟲病中，華支睪吸蟲鐵蛋白重鏈(CsFHC)通過活化HSCs的NOX、黃嘌呤氧化酶和誘導性一氧化氮合酶，導致自由基產生明顯增加，增加的自由基促進胞質IKBa降解、增加NF-κB亞基P65和P50核移位，進而促進炎癥細胞因子IL-6和IL-1β表達[25]。同時，在HCV感染過程中，HCV蛋白P27主要通過NOX4增加ROS產生，進而活化NF-κB和STAT3信號介導肝臟炎癥[26]。在非酒精性脂肪性肝炎的發病機制中，抑制Leptin-NOX軸減少NF-κB介導的micro-RNA 21表達，增加抑制型Smad7表達，從而調節TGF-β信號轉導與纖維化發生[27]。

綜上所述，氧化應激是啟動肝臟損傷和促進纖維化發展的主要機制之一，眾多肝臟損傷因素可致肝臟氧化應激，而抑制氧化應激亦可部分改善肝纖維化，但需注意非特異性抗氧化劑的補充對于氧化應激介導的疾病可能是無效甚至是有害，因此，靶向病理性ROS的來源可能是更佳的治療策略。NOX源性的ROS是眾多肝臟損傷因素引起肝臟氧化應激的關鍵機制，而NOX介導的氧化應激亦參與調控多條重要的肝纖維化相關信號通路，因此，研究以NOX為特異性靶點的藥物對于阻斷肝纖維化有重要意義。

[1] Trautwein C, Friedman SL, Schuppan D, et al. Hepatic fibrosis: Concept to treatment[J]. J Hepatol, 2015,62(1 Suppl):S15-S24.

[2] Betteridge DJ. What is oxidative stress[J]. Metabolism, 2000,49(2 Suppl 1):3-8.

[3] Panday A, Sahoo MK, Osorio D, et al. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies[J]. Cell Mol Immunol, 2015,12(1):5-23.

[4] Li S, Tan HY, Wang N, et al. The Role of Oxidative Stress and Antioxidants in Liver Diseases[J]. Int J Mol Sci, 2015,16(11):26087-26124.

[5] Altenhofer S, Radermacher KA, Kleikers PW, et al. Evolution of NADPH Oxidase Inhibitors: Selectivity and Mechanisms for Target Engagement[J]. Antioxid Redox Signal, 2015,23(5):406-427.

[6] Dusi S, Donini M, Rossi F. Mechanisms of NADPH oxidase activation: translocation of p40phox, Rac1 and Rac2 from the cytosol to the membranes in human neutrophils lacking p47phox or p67phox[J]. Biochem J, 1996,314(Pt 2):409-412.

[7] Banfi B, Clark RA, Steger K, et al. Two novel proteins activate superoxide generation by the NADPH oxidase NOX1[J]. J Biol Chem, 2003,278(6):3510-3513.

[8] Martyn KD, Frederick LM, von Loehneysen K, et al. Functional analysis of Nox4 reveals unique characteristics compared to other NADPH oxidases[J]. Cell Signal, 2006,18(1):69-82.

[9] Paik YH, Iwaisako K, Seki E, et al. The nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NOX) homologues NOX1 and NOX2/gp91(phox) mediate hepatic fibrosis in mice[J]. Hepatology, 2011,53(5):1730-1741.

[10] Lan T, Kisseleva T, Brenner DA. Deficiency of NOX1 or NOX4 Prevents Liver Inflammation and Fibrosis in Mice through Inhibition of Hepatic Stellate Cell Activation[J]. PLoS One, 2015,10(7):e129743.

[11] Xie F, Zhang Z, van Dam H, et al. Regulation of TGF-beta Superfamily Signaling by SMAD Mono-Ubiquitination[J]. Cells, 2014,3(4):981-993.

[12] Xu F, Liu C, Zhou D, et al. TGF-beta/SMAD Pathway and Its Regulation in Hepatic Fibrosis[J]. J Histochem Cytochem, 2016,64(3):157-167.

[13] Zhang L, Liu C, Meng XM, et al. Smad2 protects against TGF-beta1/Smad3-mediated collagen synthesis in human hepatic stellate cells during hepatic fibrosis[J]. Mol Cell Biochem, 2015,400(1-2):17-28.

[14] Sancho P, Mainez J, Crosas-Molist E, et al. NADPH oxidase NOX4 mediates stellate cell activation and hepatocyte cell death during liver fibrosis development[J]. PLoS One, 2012,7(9):e45285.

[15] Jiang J X, Chen X, Serizawa N, et al. Liver fibrosis and hepatocyte apoptosis are attenuated by GKT137831, a novel NOX4/NOX1 inhibitor in vivo[J]. Free Radic Biol Med, 2012,53(2):289-296.

[16] Soares-Silva M, Diniz FF, Gomes GN, et al. The Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) Pathway: Role in Immune Evasion by Trypanosomatids[J]. Front Microbiol, 2016,7:183.

[17] Shi H, Shi A, Dong L, et al. Chlorogenic acid protects against liver fibrosis in vivo and in vitro through inhibition of oxidative stress[J]. Clin Nutr, 2016,35(6):1366-1373.

[18] Adachi T, Togashi H, Suzuki A, et al. NAD(P)H oxidase plays a crucial role in PDGF-induced proliferation of hepatic stellate cells[J]. Hepatology, 2005,41(6):1272-1281.

[19] Garcia-Ruiz I, Gomez-Izquierdo E, Diaz-Sanjuan T, et al. Sp1 and Sp3 transcription factors mediate leptin-induced collagen alpha1(I) gene expression in primary culture of male rat hepatic stellate cells[J]. Endocrinology, 2012,153(12):5845-5856.

[20] Hers I, Vincent EE, Tavare JM. Akt signalling in health and disease[J]. Cell Signal, 2011,23(10):1515-1527.

[21] Cui W, Matsuno K, Iwata K, et al. NOX1/nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, reduced form (NADPH) oxidase promotes proliferation of stellate cells and aggravates liver fibrosis induced by bile duct ligation[J]. Hepatology, 2011,54(3):949-958.

[22] Wu CF, Lin YL, Huang YT. Hepatitis C virus core protein stimulates fibrogenesis in hepatic stellate cells involving the obese receptor[J]. J Cell Biochem, 2013,114(3):541-550.

[23] He W, Shi F, Zhou ZW, et al. A bioinformatic and mechanistic study elicits the antifibrotic effect of ursolic acid through the attenuation of oxidative stress with the involvement of ERK, PI3K/Akt, and p38 MAPK signaling pathways in human hepatic stellate cells and rat liver[J]. Drug Des Devel Ther, 2015(9):3989-4104.

[24] Mitchell S, Vargas J, Hoffmann A. Signaling via the NFkappaB system[J]. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med, 2016,8(3):227-241.

[25] Mao Q, Xie Z, Wang X, et al. Clonorchis sinensis ferritin heavy chain triggers free radicals and mediates inflammation signaling in human hepatic stellate cells[J]. Parasitol Res, 2015,114(2):659-670.

[26] Williams V, Brichler S, Khan E, et al. Large hepatitis delta antigen activates STAT-3 and NF-kappaB via oxidative stress[J]. J Viral Hepat, 2012,19(10):744-753.

[27] Dattaroy D, Pourhoseini S, Das S, et al. Micro-RNA 21 inhibition of SMAD7 enhances fibrogenesis via leptin-mediated NADPH oxidase in experimental and human nonalcoholic steatohepatitis[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2015,308(4):G298-G312.

國家自然科學基金資助項目(81260082)。

朱萱(E-mail：jyyfyzx@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.035

R575.2

A

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2016-09-15)