植物組織培養中的染菌及預防

蔡佩娜，傅 楸

(1.泉州市農業學校 362000， 2.泉美生物有限公司)

組織培養是一種快速發展的植物繁殖技術，已在單倍體育種、細胞突變體篩選、種苗脫毒復壯、種質資源保存與交換、植物快速繁殖、工廠化育苗等方面得到廣泛應用，并取得明顯的成效[1]。在組培過程中，無菌操作不規范，培養基、超凈工作臺、接種室消毒不徹底都會引起組培苗污染帶菌的問題，甚至會嚴重影響工作進度和生產效率，致使生產和科研試驗失敗，造成嚴重的經濟損失。因此，在植物組培育苗中降低染菌率是極為關鍵的技術環節，其中無菌操作技術和經驗積累至關重要。現將植物組織培養中的污染原因及預防措施總結如下。

1 造成污染的原因

組織培養中染菌一直是制約植物組培育苗發展的主要因素，常見的病原是細菌和真菌兩類[2]。病菌的污染給育苗造成多方面的危害，尤其是內生細菌的感染危害更為嚴重。其主要表現是早期引起育苗失敗、增殖率降低、培養苗生長緩慢、玻璃苗現象增多等[3]，后期導致移栽試管苗困難或移栽后死苗。

1.1 細菌污染

細菌污染一般在接種后1、2 d即可發生。在培養過程中，培養基出現渾濁的水漬狀，有時甚至整個培養材料周圍出現黏液狀物或發酵狀的泡沫。在細菌污染中以芽孢桿菌污染最為嚴重、最為普遍，而且芽孢桿菌對紫外線和消毒劑有一定程度的抗性，能忍受一定程度的高溫高壓，常規的高溫消毒、紫外線殺菌效果不理想。

細菌性污染形成的原因，一是由于接種材料帶菌或培養基滅菌不徹底，使得成批育苗材料受污染；二是因工作人員無菌操作不規范引起細菌侵染。

1.2 真菌污染

真菌污染一般在接種后3～8 d發生，主要是由霉菌感染。起初培養基污染的部位發霉，產生絨毛狀菌絲，隨后可產生黑色、白色、黃色、綠色的病原孢子。

真菌污染主要是周圍環境帶菌和空氣不潔凈造成的，如育苗環境不潔凈、超凈工作臺過濾裝置失效、育苗容器的開口太大、封口膜密封不嚴等原因。

2 預防措施

對于以上導致污染的各種因素，應著手從以下兩方面來預防和降低污染。一方面應控制外植體內部帶菌與外部帶菌，內部帶菌不容易滅菌，但可通過無菌培養室或溫室內的預培養來控制；外生菌可以通過表面消毒的方法進行殺菌[4]。另一方面應嚴格規范工作人員的無菌操作程序，降低操作環境染菌，可通過規范操作程序加以控制。

2.1 選擇合適的外植體

正確選擇外植體是組培取得成功的前提，一般一年生或者二年生的草本植物比多年生的木本植物帶菌少；幼嫩的材料比老的材料帶菌少；溫室培養的植物比田間生長的植物帶菌少；不帶泥土的材料比帶土的材料帶菌少。避免在陰雨天采集外植體，強烈陽光可滅殺一些真菌和細菌。對于大多數植物來說，莖尖組織生長速度快、遺傳性狀穩定，病毒感染率低，所以莖尖組織是培育無毒苗的最佳外植體。但是莖尖數量較少，因此生產中植物中上部的莖段組織也是較好的外植體。不同植物由于本身不同部位的生長特性不同，宜采集容易消毒和滅菌的部位，以降低污染帶菌率。

2.2 外植體消毒

外植體可能帶有外生菌和內生菌，必須經徹底消毒才能接種。外生菌可用表面消毒的方法滅菌，一般情況采用的消毒法：用75%酒精浸泡幾秒至1 min后，再迅速浸入0.1%升汞溶液中5～10 min[5]。一些難消毒的外植體要采用特殊的措施，如表面帶有較多絨毛的外植體可用真空減壓消毒，真空減壓抽走絨毛下的空氣，讓消毒液更容易浸入，以增強滅菌效果。使用混合的消毒液或多次消毒的方法，也可增強滅菌效果。對于內生細菌，表面消毒無法滅菌，可采用分生組織培養或反復莖尖培養的方法來脫除[6]，也可在培養基中添加抗菌素、降低pH值等方法來預防和控制內生菌的污染。

2.3 培養基滅菌

培養基與培養器皿的滅菌大都采用高壓濕熱蒸汽滅菌法以確保滅菌效果完全徹底。滅菌過程中當壓力升到0.5 kg/cm2時，開啟放氣閥將鍋內冷空氣排凈，再關閉排氣閥繼續加熱，壓力上升到1.1 kg/cm2、121℃時，保持15～20 min即可。

2.4 接種過程嚴格滅菌

接種時工作人員應嚴格規范無菌操作，避免人為因素造成染菌。要定期檢查超凈工作臺，定期對過濾器進行清洗與更換，避免操作區域帶菌。內部的過濾器每隔一定時間要檢測操作區的帶菌量，如果發現過濾失敗，則要整塊更換。此外還需要測定操作區的風速，通過調壓旋鈕使操作區的風速達到無菌操作需要的每分鐘20～30 m[7]。操作人員要做到盡量少帶菌，嚴格實驗操作，接種過程中使用的各種器具都要嚴格滅菌。接種用的器具要經高溫滅菌，每次使用后蘸酒精在酒精燈火焰上灼燒滅菌。在超凈工作臺的操作范圍內，不能放入過多的育苗材料，以免擋住氣流。感染雜菌的培養瓶在滅菌處理后才能打開洗滌。脫毒培養所用的顯微鏡不能用高溫高壓滅菌，可用75%酒精擦洗顯微鏡表面，再放在操作臺上用紫外燈殺菌。

2.5 環境消毒

不清潔的環境使培養的污染率明顯增加，因此接種室與培養室應定期凈化與消毒，接種前接種室和培養室應用紫外燈照射消毒30 min以上或用2%來蘇水消毒，定期對接種室和培養室熏蒸或噴霧消毒。甲醛和高錳酸鉀熏蒸消毒效果較好，但是對人體存在一定的傷害，通常每年熏蒸2、3次。紫外線與臭氧對環境消毒效果好，且使用靈活簡便，對人體的傷害較小。夏季、高溫高濕的環境污染率較高，要求培養室的相對濕度應控制在70%以下。

3 小結

隨著組培技術的快速發展，植物組培育苗的應用領域越來越廣闊。在育苗過程中控制或降低污染是最為關鍵的環節，既要保證控制污染的效果良好，又要力求外植體不受損傷或輕微損傷不影響生長。因此控制污染、建立潔凈培養環境、無菌的植株系統是組培育苗的努力方向[8]。

[1]吳洪生.組織培養中的染菌及預防[J].藥物生物技術,2001,8(2):239-240.

[2]周俊輝.植物快速繁殖技術中存在的問題與對策[J].仲愷農業技術學院學報,1999,12(4):64-70.

[3]韓美麗,陸榮生,黃華艷,等.綠巨人組培苗繼代過程中玻璃化苗及細菌污染的消除方法研究[J].廣西林業科學,1999,28(1):16-19.

[4]邱堅鋒.熱帶地區植物組織培養中污染的控制[J].熱帶林業科技,1987(5):72-75

[5]朱廣廉.植物組織培養中外植體滅菌[J].植物生理學通訊,1996,32(6):444-449.

[6]周俊輝,劉花全,羅慧君，等.瑪麗安萬年青莖段培養的污染防止[J].仲愷農業技術學院學報,2002,15(4);43-48.

[7]柴向華，李軍，張秀珊，等.植物組織培養中污染的控制[J].熱帶農業科學,2003，23(6)40-43.

[8]鄧小梅，奚如春.植物組織培養過程中污染現象的研究進展[J].江西林業科技，2004(6)：33-36.