CD80、CD86抗體對耗竭性T細胞效應功能的影響

孫斌，楊曉珍，郭向華，2，周育森，孫世惠，王延軍，2

(1首都醫科大學附屬北京佑安醫院,北京100069；2北京市肝病研究所；3中國軍事醫學科學院微生物流行病研究所)

CD80、CD86抗體對耗竭性T細胞效應功能的影響

孫斌1，楊曉珍1，郭向華1，2，周育森3，孫世惠3，王延軍1，2

(1首都醫科大學附屬北京佑安醫院,北京100069；2北京市肝病研究所；3中國軍事醫學科學院微生物流行病研究所)

目的以CD80、CD86抗體作為激動劑、脾細胞為研究對象，觀察CD80、CD86抗體對耗竭性T細胞效應功能的影響。方法將42只8周齡雌性 HLA-A11DR1轉基因小鼠隨機分為7組各6只，分別在8、11、14周齡時，A～F組臀部皮下接種磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)多肽，G組接種等體積無熱源PBS；A～E組在24周齡和F、G組在17周齡時脫頸處死，取脾臟并制成脾細胞懸液；A、B組分別滴加20、40 μg/mL 抗鼠CD80抗體和10 μg/mL GPC3多肽，C、D組分別滴加20、40 μg/mL 抗鼠CD86抗體和10 μg/mL GPC3多肽，E、F、G組僅滴加10 μg/mL GPC3多肽。孵育18 h后，采用酶聯斑點分析儀檢測干擾素γ(IFN-γ)，以此判斷T細胞效應功能。結果A～G組脾細胞IFN-γ陽性斑點數分別為(80.61±48.91)、(207.67±60.41)、(1.67±0.97)、(1.33±0.49)、(2.33±1.53)、(38.17±5.18)、(2.33±1.53)個。其中，F組高于E、G組(P均<0.01)，E、G組間比較無統計學差異；A組>B組>C、D、E組(P均<0.01)，C、D、E組間比較差異無統計學意義；而且，IFN-γ陽性斑點數隨著CD80抗體濃度升高而增加，二者呈正相關(r=0.760 5，P<0.01)。結論CD80抗體能夠刺激耗竭性T細胞恢復產生細胞因子，且呈劑量依賴的動力效應;而CD86抗體未能檢測到該功能。

CD80抗體；CD86抗體；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；多肽疫苗；T細胞耗竭；干擾素γ

脾細胞主要成分為T細胞和B細胞，T細胞受到肽刺激會產生干擾素γ(IFN-γ),而B細胞則不能。因此，動物免疫實驗中常用肽刺激小鼠脾細胞并檢測IFN-γ的分泌情況，以分析T細胞功能。刺激CD8+T細胞活化并分化為效應性T細胞，是免疫系統保護宿主、清除病原微生物或腫瘤抗原的關鍵。然而，在腫瘤微環境中，常由于T細胞疲勞耗竭，而致抗腫瘤應答能力弱、效率低下，不能有效識別和清除腫瘤細胞[1]；T細胞耗竭的形成通常是由于抗原持續性存在，缺乏輔助性“幫助”信號引起，從而抑制有效免疫應答的形成。通過治療性疫苗來增強原本微弱的抗腫瘤反應，一直是科學家長期以來所尋求的治療癌癥目標[2～4]。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是在肝癌組織中高表達的癌胚抗原(72%～81%)[5, 6]，組織特異性強，且與預后不良相關[5]，是肝癌免疫治療的理想靶抗原[5,7～9]。2016年1～12月，我們以CD80、CD86抗體作為激動劑，刺激GPC3疫苗接種后期的耗竭性T細胞，觀察其恢復效應性功能的效果。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雌性 HLA-A11DR1轉基因小鼠48只，由軍事醫學科學院周育森教授研究組構建，購自軍事醫學科學院實驗動物中心；抗鼠 CD80、CD86抗體均購自eBioscience公司，GPC3多肽由上海強耀生物公司合成；弗氏完全佐劑、不完全佐劑和植物凝集素(PHA)均購自Sigma 公司；Elispot小鼠IFN-γ檢測試劑盒、ACE顯色底物和Falcon細胞篩網均購自BD公司；細胞培養用RPMI 1640培養基、胎牛血清和無熱源PBS緩沖液均購自Gibco公司；酶聯斑點分析儀購自美國CTL公司。

1.2 動物分組與免疫接種 將42只小鼠隨機分為7組各6只，A～F組接種GPC3多肽，G組接種等體積無熱源PBS，免疫途徑和方法相同。具體方法：將100 μg GPC3多肽與50 μL弗氏完全佐劑按照1∶1的體積比混合(總體積100 μL)，并用組織勻漿機乳化，使之達到油包水的效果；分別在8、11、14周齡時，于小鼠臀部皮下注射GPC3多肽100 μL/只。

1.3 脾細胞制備與刺激處理 A～E組在24周齡和F、G組在17周齡時，將小鼠頸椎脫臼處死并取脾臟，經細胞篩網組織碾磨后獲得脾細胞懸液，調整細胞密度至2×106/mL。將各組細接種在96孔板，2×105/孔。A、B組分別滴加20、40 μg/mL 抗鼠CD80抗體和10 μg/mL GPC3多肽，C、D組分別滴加20、40 μg/mL 抗鼠CD86抗體和10 μg/mL GPC3，E、F、G組僅滴加10 μg/mL GPC3多肽。每孔總體積100 μL，陽性對照孔中加入5 μg/mL PHA。

1.4 T細胞效應功能觀察 采用酶聯斑點分析法。取各組孵育18 h的細胞，加入辣根過氧化物酶標記的IFN-γ二抗，室溫放置3 h；每孔加入100 μL TMB底物溶液，室溫顯色10～15 min，陽性對照孔出現深紫色斑點即可停止顯色。采用酶聯斑點分析儀讀取IFN-γ陽性免疫斑點數，斑點數越多表明T細胞效應功能越強。

2 結果

孵育18 h后，A～G組脾細胞IFN-γ陽性免疫斑點數分別為(80.61±48.91)、(207.67±60.41)、(1.67±0.97)、(1.33±0.49)、(2.33±1.53)、(38.17±5.18)、(2.33±1.53)個。其中F組高于E、G組(P均<0.01)，E、G組間比較無統計學差異，表明免疫接種小鼠在免疫應答后期可能出現了T細胞耗竭。A組>B組>C、D、E組(P均<0.01)，C、D、E組間比較差異無統計學意義；而且，IFN-γ陽性免疫斑點數隨著CD80抗體濃度升高而增加，二者呈正相關(r=0.760 5，P<0.01)。

3 討論

誘導產生持續性腫瘤抗原特異性CD8+T細胞應答，是保障治療性癌癥疫苗效應的基本要素。大量研究表明，CD8+T細胞必須受到活化的專職抗原提呈細胞(pAPCs)所產生的輔助信號刺激，才能激活并分化為效應性T細胞[9]。GPC3是肝癌免疫治療的理想靶抗原，其多肽疫苗在HLA-A11陽性人群中具有良好的免疫反應性。本研究將GPC3多肽疫苗免疫接種HLA-A11DR1轉基因小鼠，在17周齡時可誘導產生顯著的GPC3特異性T細胞應答，而在24周齡時特異性T細胞應答明顯減弱，表現為特征性的T 細胞耗竭狀態，可能是由于輔助信號缺失引起。

B7家族分子CD80和CD86均是T細胞表面協同刺激分子CD28的配體，二者具有高度同源性，與CD28結合后產生T細胞活化所需的輔助信號，刺激T細胞增殖分化并發揮效應功能。CTLA-4分子是T細胞表面協同刺激分子CD28的結構同源體，二者均能與B7家族分子CD80和CD86功能性結合，但CTLA-4是T細胞表面的抑制性受體；CTLA-4與B7分子的親合力大大強于CD28，故一旦CTLA-4表達在活化T細胞表面，它將降低T細胞活性，抑制細胞增殖和細胞因子分泌[14]。腫瘤微環境中的特異性效應T細胞功能耗竭[14]，往往與T細胞表面抑制性受體過度表達有關[15]。本研究中將CD80抗體與功能耗竭的T細胞共孵育后，細胞因子分泌顯著增加，而且呈劑量依賴的動力效應。這表明CD80抗體阻斷CD80分子與抑制性受體CTLA-4結合，抑制性信號減少，T細胞功能得以恢復。因此，CD80抗體可作為激動劑，刺激耗竭性T細胞恢復效應性功能。然而，CD86雖同為B7家族分子，其抗體與功能耗竭的T細胞共孵育后，未檢測到細胞因子分泌功能的變化，其機制尚需進一步研究。

迄今，已有足夠多的研究表明肝癌患者的腫瘤特異性T細胞功能低下[10～12]，而近95%的成年急性乙肝病毒(HBV)感染者則表現出強勁的HBV特異性CD8+T細胞應答。腫瘤患者T細胞功能損害與內源性免疫抑制調節機制，即免疫檢查點(IC)活化[11, 13]有關；由于CTLA-4是免疫檢查點的關鍵分子，它已成為克服免疫應答抑制性調節的理想靶點[15]。然而，CTLA-4組織分布廣泛，其表達無腫瘤特異性(除某些骨髓瘤和淋巴瘤外)。阻斷CTLA-4可能導致機體免疫抑制機制缺失，免疫失衡紊亂，繼而引發劇烈致死性自身免疫?。籆TLA-4敲除鼠的超免疫表型也表明，阻斷該受體易導致強烈的免疫毒性副作用，此類研究結果使得封閉CTLA-4的治療策略不斷受到質疑[13,15]。

在我們的研究中，CD80抗體能夠使耗竭性T細胞恢復產生細胞因子，而且呈劑量依賴性。相較于CTLA-4抗體，CD80抗體僅部分阻斷CTLA-4信號；CD86分子仍然可以與CTLA-4受體相結合，產生抑制性信號，維持免疫系統平衡穩定，從避免了完全阻斷該受體引起的劇烈自身免疫病。這些突出顯示了選擇性靶向CD80分子，部分阻斷CTLA-4抑制性信號，恢復T細胞功能，在腫瘤免疫治療中的潛在優勢。

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Influence of CD80 and CD86 antibody on effector function of exhausted T cells

SUNBin1,YANGXiaozhen,GUOXianghua,ZHOUYusen,SUNShihui,WANGYanjun1,2*

(1BeijingYouanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

ObjectiveTo investigate the effects of CD80 and CD86 antibody on the effector function of exhausted T cells.MethodsForty-two female HLA-A11DR1 transgenic mice were randomly divided into 7 groups (n=6). The mice in groups A-F were subcutaneously inoculated with phosphatidylinositol 3 (GPC3) at the age of 8 weeks (week 8), at week 11 and week 14, respectively. Mice in the group G were inoculated with the same volume of heat-free PBS as controls. Mice in the groups A-E were sacrificed at week 24, and groups F and G at week 17. Splenocytes suspension was made. Then, 20 or 40 μg/mL CD80 antibody and 10 μg/mL GPC3 peptide were pipetted in the splenocytes of groups A and B; 20 or 40 μg/mL CD86 antibody and 10 μg/mL GPC3 were pipetted in the groups C and D, respectively; 10 μg/mL GPC3 peptide was pipetted in the groups E, F, and G. After incubation for 18 h, interferon-γ (IFN-γ) was measured by enzyme-linked spot analyzer for analysis of T cell function.ResultsIFN-γ positive spots in the groups A-G were 80.61±48.91, 207.67±60.41, 1.67±0.97, 1.33±0.49, 2.33±1.53, 38.17±5.18 and 2.33±1.53, respectively. Among them, group F was significantly higher than groups E and G (bothP<0.01). There was no significant difference between groups E and G (bothP<0.01). Group A was more than group B, and group B was significantly more than group C, D and E (allP<0.01). There was no significant difference among groups C, D and E. In addition, the number of IFN-γ positive spots was positively correlated with CD80 antibody concentration (r=0.7605,P<0.01).ConclusionsAnti-CD80 could restore the exhausted T cells to secret IFN-γ with a dose-dependent manner, while anti-CD86 could not be detected for the same effect.

CD80 antibody; CD86 antibody; phosphatidylinositol 3; peptide vaccine; T cell exhaustion; interferon-γ

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.007

R392.5；R575.1

A

1002-266X(2017)34-0024-03

2017-08-04)

北京市科學技術委員會首都市民健康項目(Z141100002114002)；北京市衛生系統高層次衛生技術人才項目(2014-3-092)。

孫斌(1971-)，男，博士，主任醫師，主要研究方向腫瘤及肝病的介入治療。E-mail: sb5368@hotmail.com

王延軍(1971-)，女，博士，研究員，主要研究方向為肝病的免疫機制及免疫治療。E-mail: yjunwang@ccmu.edu.cn

孫世惠(1968-)，女，副研究員，主要研究方向為轉基因動物模型及病原感染免疫致病機制。E-mail: sunsh01@163.com