FAM96A在人肝癌組織中表達及其對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響

廖宇圣，張姮，黃曼玲，田俊

(1華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院, 武漢 430070；2華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院)

FAM96A在人肝癌組織中表達及其對肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響

廖宇圣1，張姮1，黃曼玲1，田俊2

(1華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院, 武漢 430070；2華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院)

目的觀察96序列相似的家庭成員A(FAM96A)在人肝癌組織中的表達并探討其對人肝癌細胞系HepG2細胞增殖及凋亡的影響。方法采用實時熒光定量聚合酶鏈反應及免疫印跡法檢測FAM96A蛋白在肝癌組織和癌旁組織、HepG2細胞和L02細胞中的mRNA及蛋白表達量。采用脂質體轉染法將含人FAM96A全長序列的pcDNA3.1-myc-FAM96A重組質粒轉染至HepG2細胞中，取對數生長期的HepG2細胞，24 h后分為FAM96A組和對照組，分別轉染pcDNA3.1-myc-FAM96A質粒和pcDNA3.1-vector空白質粒。采用MTT法及流式細胞技術檢測兩組HepG2細胞增殖活力和凋亡率。結果FAM96A mRNA在肝癌組織、癌旁組織中的相對表達量分別為0.704±0.178、1.707±0.267,在HepG2細胞、L02細胞中的相對表達量分別為0.627±0.251、1.654±0.285，兩者比較，P均lt;0.05。FAM96A蛋白在肝癌組織中的表達低于癌旁組織、在HepG2細胞中的表達低于L02細胞，P均lt;0.05。FAM96A組細胞增殖活力低于對照組(Plt;0.05)，FAM96A組、對照組細胞凋亡率分別為33.06%±3.15%、5.08%±0.75%，兩組比較，Plt;0.05。結論FAM96A在人肝癌組織中表達下降，過表達FAM96A可抑制肝癌細胞增殖且誘導其凋亡。

肝腫瘤；96序列相似的家庭成員A;細胞增殖; 細胞凋亡

原發性肝細胞癌(簡稱肝癌)是我國常見的惡性腫瘤之一[1]。肝癌的病死率在癌癥相關死因中位列第三，5年生存率僅為10%,復發和轉移是導致患者長期生存率較低的主要原因，機制不明[2，3]。肝癌的發生發展是癌基因激活或(和)抑癌基因失活在內的多階段多步驟過程。96序列相似的家庭成員A (FAM96A) 是普遍存在、高度保守的凋亡激活蛋白，其生物學功能尚不明確[4]。目前國內外關于FAM96A 的研究報道甚少，FAM96A在肝癌發生發展中的功能未知。2015年1月～2016年12月，我們觀察了FAM96A在肝癌組織和細胞中的表達差異,并探討其對肝癌細胞系HepG2細胞增殖、凋亡的影響，以期為尋找肝癌新的治療靶點提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院2015年1月～2016年12月的48例人肝癌組織及配對癌旁(距腫瘤邊緣gt;2 cm)組織標本，患者男34例、女14例，年齡≤50歲30例，gt;50歲18例；腫瘤直徑：≤5 cm 18例，gt;5 cm 30例；腫瘤數目：單發31例，多發17例；乙肝表面抗原：陽性41例，陰性7例；肝硬化：有38例，無10例；血清AFP：≤20 ng/mL 15例，gt;20 ng/mL 33例；門靜脈癌栓：有13例，無35例；肝外轉移:陽性8例，陰性40例；Child分級：A級39例，B級9例；BCLC分期:A期28例，B+C期20例。標本均經本院病理科診斷證實為原發性肝癌。48例肝癌組織標本及配對的癌旁組織標本離體后立即置入液氮中保存。標本的獲取均得到患者本人及家屬同意，并通過我院倫理委員會批準。

1.2 FAM96A mRNA表達檢測 采用Real-time PCR法。按照TRIzol試劑盒操作說明書提取48例肝癌組織及配對癌旁組織、L02細胞、HepG2細胞的總mRNA。人肝癌細胞系HepG2細胞、人正常胎肝L02細胞均保存于本院中心實驗室。FAM96A正向引物：5′-GCAAAGCACGCTGGAACT-3′，反向引物：5′-GGCCGAGACAAGCCTAAA-3′；β-actin正向引物：5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′，反向引物：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′。均由上海英駿生物工程技術服務公司設計并合成。利用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA，低溫保存備用。Real-time PCR總反應體系為20 μL，其中2×SYBR Green mix緩沖液10 μL，正反向引物各0.6 μL(濃度為10 μmol/L)，cDNA 2 μL，DEPC水補齊至20 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s；共35個循環；72 ℃終延伸5 min。每個樣本均做3個復孔，并重復3次。各組中FAM96A的相對表達量通過2-ΔΔCt法進行計算。

1.3 FAM96A蛋白表達檢測 采用Western blotting法。分別稱取0.08 g肝癌組織和癌旁組織，收集L02細胞及HepG2細胞，加800 μL全蛋白提取液提取蛋白，Bradford法蛋白定量。各組取120 μg上樣于5.0%濃縮膠，15%分離膠，行SDS-PAGE電泳分離。轉移蛋白于PVDF膜，5%脫脂奶粉稀釋的FAM96A及β-actin一抗封閉，4 ℃過夜，HRP標記二抗，37 ℃溫育,化學發光法顯影檢測蛋白表達。免疫印跡條帶的灰度值經灰度掃描儀分析后獲得。

1.4 HepG2細胞增殖活力檢測 采用MTT法。取對數生長期的HepG2細胞接種于96孔板,每孔約100 μL，24 h后轉染，分為FAM96A組和對照組，分別轉染pcDNA3.1-myc-FAM96A質粒、pcDNA3.1-vector空白質粒。DMEM培養基(含10%FBS)培養1～4 d，每孔加5 mg/mL的MTT溶液20 μL，孵育1 h后棄上清液，每孔加DMSO 150 μL，酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度(A)值，繪制細胞生長曲線，其中橫坐標為時間，縱坐標為A值。

1.5 HepG2細胞凋亡率檢測 收集細胞，按照說明書加Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL混勻，用流式細胞儀檢測FITC,利用CellQuest軟件獲取并計算細胞凋亡率。

2 結果

2.1 FAM96A在肝癌、癌旁組織中的表達比較 FAM96A mRNA在肝癌、癌旁組織中的相對表達量分別為0.704±0.178、1.707±0.267,二者比較，P=0.000。FAM96A蛋白在肝癌、癌旁組織中的相對表達量分別為0.701±0.207、1.452±0.262，二者比較，P=0.000。

2.2 FAM96A在HepG2細胞、L02細胞中的表達比較 FAM96A mRNA 在HepG2細胞、L02細胞中的相對表達量分別為0.627±0.251、1.654±0.285,二者比較，P=0.000。FAM96A蛋白在HepG2細胞、L02細胞中的相對表達量分別為0.612±0.245、1.375±0.271，二者比較，P=0.000。

2.3 HepG2細胞增殖活力比較 轉染第1天，FAM96A組、對照組A值分別為0.152±0.031、0.156±0.037；轉染第2天，A值分別為0.305±0.039、0.412 ±0.036；轉染第3天，A值分別為0.432±0.094、0.714±0.054；轉染第4天，A值分別為0.604±0.061、0.902±0.063；轉染第2～4天，FAM96A組A值低于對照組(P均lt;0.05)。

2.4 HepG2細胞凋亡率比較 FAM96A組、對照組細胞凋亡率分別為33.06%±3.15%、5.08%±0.75%，兩者比較，P=0。

3 討論

FAM96A與FAM96B屬同源蛋白，通過與其相互作用蛋白復合而發揮功能。研究[4]表明，FAM96A、FAM96B、CIA1及胞質鐵硫蛋白簇聚集系統的靶因子MMS19組成蛋白復合物發揮作用。FAM96B-CIA1-MMS19蛋白復合物促進多數胞質-胞核鐵硫蛋白的組裝。FAM96A-CIA1蛋白復合物特異性促進鐵調節蛋白1成熟，從而維持細胞鐵穩態。目前國內外對FAM96B的功能研究已取得突破性進展[5～8]，然而關于FAM96A的研究報道甚少。

在腫瘤組織及其相應鄰近正常組織的差異性表達是分析基因與腫瘤關系的基礎，異常表達的基因可能在腫瘤形成中扮演重要角色，可認為是潛在的新一類控制細胞增殖和凋亡的癌基因和抑癌基因[9]。本研究中Real-time PCR和Western blotting檢測結果均顯示FAM96A在肝癌組織中的表達低于癌旁組織，差異有統計學意義，且在人肝癌細胞系HepG2中的表達低于人正常胎肝細胞系L02，差異有統計學意義。可見,FAM96A在肝癌發生發展過程中扮演重要角色?？赡苁且职┗蛲ㄟ^間接作用抑制肝癌和其他腫瘤的發生發展。Zhang等[10]從動物水平探索FAM96A功能，建立H22荷瘤模型，觀察FAM96A對小鼠的抑瘤作用，研究結果表明FAM96A抑制腫瘤細胞生長，誘導細胞凋亡。本研究分別從人體組織標本及人肝癌細胞系兩方面證實FAM96A可能是潛在抑癌基因，在肝癌發生發展中發揮抑制作用。與國外文獻報道基本一致。

目前，研究[11]認為基因克隆、基因轉染是明確基因功能的主要方法。肝癌HepG2細胞容易獲得及培養，且轉染效率高。因此，本研究將FAM96A質粒通過脂質體轉染法轉染至HepG2細胞中，觀察FAM96A基因過表達對肝癌細胞生物學功能的影響。本研究中，MTT實驗結果提示FAM96A組細胞的增殖速度低于對照組，即過表達FAM96A可抑制肝癌細胞增殖，流式細胞儀檢測結果顯示過表達FAM96A可誘導HepG2細胞凋亡。

本研究結果表明，FAM96A在肝癌組織及肝癌細胞系HepG2表達下降，且抑制HepG2細胞增殖，并誘導其凋亡。因此，FAM96A可作為一種新的抑癌基因而抑制肝癌的發生發展。

[1] 中國抗癌協會肝癌專業委員會，中國抗癌協會臨床腫瘤學協作專業委員會,中華醫學會肝病學分會肝癌學組.原發性肝癌規范化診治的專家共識[J].中華肝臟病雜志，2009，17(6)：403-410.

[2] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[3] Altekruse SF, McGlynn KA, Reichman ME. Hepatocellular carcinoma incidence, mortality, and survival trends in the United States from 1975 to 2005[J]. J Clin Oncol, 2009,27(9):1485-1491.

[4] Stehling O, Mascarenhas J, Vashisht AA, et al. Human CIA2A-FAM96A and CIA2B-FAM96B integrate iron homeostasis and maturation of different subsets of cytosolic-nuclear iron-sulfur proteins[J]. Cell Metal, 2013,18(2):187-198.

[5] Ito S, Tan LJ, Andoh D, et al. MMXD, a TFIIH-independent XPD-MMS19 protein complex involved in chromosome segregation[J]. Mol Cell, 2010,39(4):632-640.

[6] Yang W, Itoh F, Ohya H, et al. Interference of E2-2-mediated effect in endothelial cells by FAM96B through its limited expression of E2-2[J]. Cancer Sci, 2011,102(10):1808-1814.

[7] 張智勇，蔡遜，馬丹丹，等.96序列相似的家庭成員B在肝癌中的表達變化及功能研究[J].中華實驗外科雜志，2014,31(7)：1489-1491.

[8] 蔡遜，馬丹丹，田俊，等.FAM96B基因在結腸癌組織中低表達且抑制癌細胞增殖并誘導其凋亡[J].華中科技大學學報(醫學版)，2016，45(2)：132-135.

[9] Si ML, Zhu S, Wu H, et al. MiR-21 mediated tumor growth[J]. Oncogene, 2007,26(19):2799-2803.

[10] Zhang MY, Wang JP. A multi-target protein of hTERTR-FAM96A presents significant anticancer potent in the treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Tumor Biol, 2017,39(4):1-10.

[11] 翟保平，李文濤，張斌，等.人類DCC基因克隆及真核表達載體構建于鑒定[J].中華實驗外科雜志，2011,28(2)：226-228.

ExpressionofFAM96AinhumanlivercancertissuesanditseffectonproliferationandapoptosisofhumanlivercancerHepG2cells

LIAOYusheng1,ZHANGHeng,HUANGManling,TIANJun

(1TheCentralHospitalofWuhanAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430070,China)

ObjectiveTo investigate the expression of family with sequence similarity 96 member A(FAM96A)in the liver cancer tissues and to evaluate its effects on the cell proliferation and apoptosis of human liver cancer cells HepG2.MethodsReal-time PCR and Western blotting were applied to detect the mRNA and protein expression levels of FAM96A in the liver cancer tissues and their adjacent tissues, HepG2 cells and L02 cells. Furthermore, the recombinant plasmid of pcDNA3.1-myc-FAM96A containing the whole sequence of human FAM96A gene (FAM96A group) and pcDNA3.1-vector pcDNA3.1-vector blank plasmid (control group) were respectively transfected into HepG2 cells. Then MTT essay and flow cytometry were applied to detect the proliferation and apoptosis rate of HepG2 cells in the two groups.ResultsFAM96A mRNA levels were significantly decreased in the liver tissues than in the adjacent tissues (0.704±0.178 vs. 1.707±0.267) and in HepG2 cells than in L02 cells (0.627±0.251 vs. 1.654±0.285), (bothPlt;0.05). While FAM96A protein expression levels were lower in the liver tissues as compared with those of the adjacent tissues and were lower in HepG2 cells than in L02 cells ( bothPlt;0.05). Moreover, MTT assay showed that the proliferation of the FAM96A group was significantly lower than that of the control group (Plt;0.05). FACS analysis indicated that the apoptotic rate was higher in the FAM96A group than in the control group (33.06%±3.15% vs. 5.08%±0.75%), (Plt;0.05).ConclusionThe FAM96A expression is significantly decreased in the liver cancer tissues and overexpression of FAM96A can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of HepG2 cells.

liver neoplasms; family with sequence similarity 96 member A (FAM96A); cell proliferation; apoptosis

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.003

R735.7

A

1002-266X(2017)41-0009-03

國家自然科學基金資助項目(81350006)。

廖宇圣(1977-),男，醫學碩士，副主任醫師，主要研究方向為FAM96A與FAM96B在消化系統腫瘤中的表達及功能研究。E-mail：63669165@qq.com

張姮(1973-)女，醫學博士，主任醫師，主要研究方向為FAM96A與FAM96B的功能與機制研究。E-mail：653262549@qq.com

2017-07-12)