降水對日本菊花螺胚胎發育和幼體孵化的影響

王 偉, 丁孟文, 董云偉,

(1. 廈門大學 海洋與地球學院 近海海洋環境科學國家重點實驗室, 福建 廈門 361102; 2. 廈門市海灣生態保護與修復重點實驗室, 福建 廈門 361102)

日本菊花螺Siphonaria japonica(Donovan, 1824)隸屬于軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、肺螺亞綱(Pulmonata), 是棲息于我國及日本沿岸巖相潮間帶中高潮區的常見腹足類[1-4]。作為我國巖相潮間帶重要的牧食者, 日本菊花螺對潮間帶藻類的組成和豐度具有重要的調節作用, 進而通過食物鏈的上行效應對其他營養級產生重要影響[5]。除此以外,日本菊花螺也具有重要的應用價值, 從其體內分離得到的聚丙酸酯類化合物有清涼解毒的功效, 具有重要的藥用價值[6]。

日本菊花螺幼體發育過程可分為胚胎發育和幼體發育階段[7], 胚胎發育發生在卵帶內, 而幼體發育發生在卵帶外。日本菊花螺卵帶由包裹胚胎的卵囊和卵囊外的凝膠狀物質組成。胚胎發育階段在潮間帶巖石上完成, 分為多細胞期(卵裂期)、囊胚期、原腸胚期、擔輪幼體和面盤幼體5個時期[8]。經過4~20 d胚胎發育之后, 幼體從卵帶中釋放出來, 進行浮游生活, 然后附著于潮間帶成為稚貝[1]。這種繁殖方式具有以下優勢: 其一, 可以兼顧種群在原棲息地的延續和種群的有效擴散[9]; 其二, 卵帶內胚胎發育可保證發育早期的營養供給[9], 同時減少早期胚胎被攝食的幾率和防止原生生物、細菌和病毒的侵入[10]。但是, 將卵帶產在潮間帶會面臨著潮間帶嚴酷的環境脅迫, 劇烈的溫度、鹽度和濕度的變化都會影響卵帶內胚胎發育和幼體孵化, 進而在更高的組織水平上產生重要影響[10]。

海洋貝類幼體發育和稚貝生長均需要適宜的鹽度環境[11-13]。降水會快速降低潮間帶鹽度, 因此影響潮間帶腹足類胚胎和幼體發育。關于鹽度對腹足類卵帶胚胎發育和幼體孵化的影響, 國內外已有大量報道[10,14-18]。但大部分研究工作著重于通過分析卵帶在不同梯度海水中時胚胎發育和幼體孵化的狀況,探討卵帶在鹽度變化時受到的脅迫。這些研究很少考慮到潮汐和降水的作用, 無法全面闡釋降水對卵帶胚胎發育和幼體孵化的影響。本研究通過實驗室模擬和原位取樣相結合的方式, 旨在研究降水對日本菊花螺卵帶胚胎發育和幼體孵化產生的影響, 為闡明降水對潮間帶腹足類的繁殖和種群動態的影響提供重要的基礎數據。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

室內模擬降水實驗使用的卵帶來自實驗室暫養的日本菊花螺成體, 成體于2015年3月17日采集自福建廈門(118°14′E, 24°42′N), 殼長 15.89 mm±1.66 mm,殼寬 11.37 mm±1.49 mm, 殼高 4.77 mm±0.56 mm,濕重 493.49 mg±158.49 mg(平均值±標準差, n=30)。日本菊花螺暫養條件: 水溫與環境溫度均為 24 °C;鹽度為28; 光照條件為12 h: 12 h; 早晚各噴海水2 h,產出的卵帶及時取出用于后續實驗。

1.2　 實驗方法

1.2.1模擬降水對卵帶內胚胎發育的影響

暫養的日本菊花螺成體在2015年3月22日產下 32枚卵帶被用于該實驗, 經過顯微鏡鏡檢, 確認卵帶內胚胎均處于多細胞期(卵裂期)。隨機將卵帶分為2組, 對照組和模擬降水組(下文簡稱降水組)各16枚卵帶, 隨機置于自制的兩套貝類培養裝置, 分別使用海水(鹽度28)和淡水(鹽度0)噴淋1 h。經過噴淋之后, 每個卵帶被單獨放置在玻璃培養皿(直徑 6 cm)中, 加入20 mL經過0.22 μL膜濾過的海水(鹽度28),放置于人工氣候箱中孵育(溫度為24℃, 光照條件為12 h∶12 h, 每隔1 d換1次海水)。在孵育時間分別為12、36、72和96 h時(前期觀察發現在這4個時間點時, 卵帶內大部分胚胎會正常發育到囊胚期、原腸胚期、擔輪幼體和面盤幼體), 在降水組和對照組中, 各隨機選取 4枚卵帶在倒置顯微鏡下觀察胚胎發育狀況。每枚卵帶分別選取兩邊和中間共 5個部分進行觀察, 每個部分隨機觀察20個胚胎。每枚卵帶共計觀察 100個胚胎的發育狀況, 以統計卵帶內胚胎發育的狀況。卵帶內各時期胚胎的判斷方法參考Oca?a和Emson的研究[8]: 囊胚的內陷代表胚胎進入原腸胚期; 初生殼和纖毛的出現代表胚胎進入擔輪幼體時期; 厴內臟器官的分化和 的形成表明胚胎發育為面盤幼體。

1.2.2模擬降水對卵帶幼體孵化的影響

暫養的日本菊花螺成體在3月25日產下30枚卵帶被用于該實驗。隨機將卵帶分為降水組和對照組(各 15枚卵帶), 分別使用海水(鹽度 28)和淡水(鹽度0)噴淋1 h。噴淋結束后, 每枚卵帶經過簡單吸干處理后稱取重量, 單獨放入玻璃培養皿并標記, 加入20 mL膜濾海水。孵化條件與1.2.1中所描述的相同, 每隔1 d換水1次, 在換水的同時, 檢測水體中浮游幼體的數量。檢測方法為: 使用1 mL的浮游動物計數框在倒置顯微鏡下檢測浮游幼體的數量, 每個卵帶孵育的水體(20 mL)檢測3個1 mL子樣品, 得到平均密度, 再乘以 20 mL的體積, 得到該檢測周期內(2 d)該卵帶所產出的浮游幼體數量。

1.2.3自然降水對卵帶幼體孵化的影響

在2015年4月20日16: 00~23: 00, 廈門經歷了7 h降水, 總降水量為10 mm, 達到中雨級別(降水量等級 GB/T 28592-2012, (5~14.9) mm/12 h 或 (10~24.9) mm/24 h), 降水期間潮高均低于350 cm (相對于黃海基準面, 日本菊花螺的分布主要在高程為 300~400 cm的中潮間帶區域), 因此日本菊花螺卵帶受到了整個降水過程的影響。此次降水之前一個星期內并無其他降水, 保證所采集的卵帶僅經歷了單次降水。4月21日早上從潮間帶取回卵帶超過70枚, 經過倒置顯微鏡鏡檢之后, 選取處于多細胞期、囊胚期、原腸胚期和擔輪幼體的卵帶各10枚, 作為降水組, 命名為A1、A2、A3、A4。每枚實驗用卵帶經過稱重后, 放入單獨的玻璃培養皿并標記, 加入20 mL膜濾海水。孵化條件與1.2.1中所描述的相同, 每隔1 d換水1次, 在換水的同時檢測水體中幼體的數量(檢查方法同1.2.2中描述)。

由于4月21日—4月28日內無降水, 因此在4月28日采集卵帶70枚, 鏡檢之后選擇與上述一致的4個時期的卵帶作為對照組命名為B1、B2、B3、B4,平行數分別為10、9、9、3。對照組卵帶的孵化條件和幼體數量檢測方法與降水組相同。

1.3　數據處理

通過對卵帶孵化過程的高斯模擬得到每個卵帶單位時間幼體孵化最高值和最高值出現時間。高斯模擬模式圖(圖1)以B2組2號平行的數據作為作圖數據。振幅值(Amplitude Value)和高峰值(Mean Value)的生物學意義分別為單位時間幼體孵化最高值和最高值出現時間。高斯模擬通過Graphpad Prism 6軟件完成。

圖1　卵帶幼體孵化的高斯模擬模式圖Fig. 1 The Gaussian simulation of larval hatching from egg ribbons of Siphonaria japonica

數據的統計分析通過SPSS 20.0完成。其中模擬降水實驗中降水組和對照組之間胚胎發育狀況的比較采用非參數檢驗-頻數表統計方法中的雙樣本Kolmogorov-Smirnov 檢驗, P<0.05認為差異顯著;室內模擬降水實驗和原位自然降水實驗中降水組和對照組之間幼體孵化的比較采用重復測量方差分析方法, P<0.05認為差異顯著; 此外, 利用獨立樣本 t檢驗方法分析室內模擬降水實驗和原位自然降水實驗中降水組和對照組之間各檢測時間點累積孵化數以及高斯模擬中振幅值、高峰值的差異, P<0.05認為差異顯著。

2　結果

2.1　模擬降水對卵帶內胚胎發育的影響

經歷模擬降水之后, 日本菊花螺卵帶胚胎發育受到顯著影響(圖2)。在12、36、72和96 h, 對照組卵帶胚胎發育至囊胚期、原腸胚期、擔輪幼體和面盤幼體的比例分別為 69.50%、54.00%、41.50%和61.00%, 降水組卵帶胚胎發育至該 4個時期的比例僅為65.25%、30.75%、5.50%和21.25%。在孵育時間為96 h時, 降水組卵帶中處于多細胞期、囊胚期、原腸胚期、擔輪幼體的比例還分別達到 4.75%、35.00%、21.50%和17.50%。非參數檢驗分析結果顯示, 除了在12 h時(P=0.863)以外, 在其他3個時間點, 降水組和對照組之間卵帶內胚胎的發育情況存在極顯著的差異(P<0.01), 說明降水組卵帶胚胎發育存在明顯的滯育現象。

2.2　模擬降水對卵帶幼體孵化的影響

實驗設計中降水組和對照組的平行數均為15個,但兩組中的卵帶均有一部分被原生動物污染, 因此降水組和對照組的生物平行最終分別為 9個和 13個。重復測量方差分析結果顯示, 降水對卵帶幼體孵化有顯著影響(P=0.05)。經歷模擬降水之后, 各檢測時間點降水組累積幼體孵化數均小于對照組。獨立樣本t檢驗結果顯示, 從降水刺激后的第20 d起到第32 d, 對照組和降水組的累積幼體孵化數均存在顯著的差異(P值為0.038~0.043)。綜合分析, 模擬降水會顯著影響到幼體孵化。利用獨立樣本t檢驗方法分析發現, 對照組和降水組的振幅值、高峰值之間均不存在顯著差異(P>0.05; 表 1和表 2), 表明室內模擬降水并不影響卵帶單位時間幼體孵化最高值和最高值出現時間。

圖2　模擬降水后降水組和對照組卵帶內胚胎發育狀況Fig. 2 Development of egg ribbons in the control and treatment groups with simulated rainfall圖中**號表示組間存在極顯著差異The double asterisk (**) represents significant differences between the control and treatment (P<0.01)

2.3　自然降水對卵帶幼體孵化的影響

經歷自然降水之后, A1、A2、A3、A4組卵帶與相對應的對照組在最終幼體孵化數上均無顯著差異(獨立樣本t檢驗, P>0.05; 圖4)。重復測量方差分析結果也顯示, 各個時期的對照組和降水組之間卵帶的幼體孵化不存在顯著差異(P>0.05)。利用獨立樣本t檢驗方法分析各個時期的對照組和降水組的振幅值、高峰值結果表明: 各時期的對照組和降水組振幅值之間均不存在顯著差異(P>0.05), 說明自然降水并不影響卵帶單位時間內幼體孵化的最高值(表1)。但是各時期對照組高峰值均顯著大于對應的降水組(P<0.05), 差值為1 d左右(表2)。表明在經歷自然降水之后, 雖然降水對卵帶幼體孵化數并未受到影響,但幼體孵化的高峰期提前, 幼體孵化速率明顯加快。

3　討論

日本菊花螺卵帶能為胚胎提供保護, 有效抵御淡水所造成的影響。自然降水實驗表明, 卵帶在經歷自然降水后, 累積幼體孵化數和單位時間幼體孵化最高值并沒有受到顯著影響。以往研究表明[14,17-18],潮間帶和河口區腹足類產出的卵帶對低鹽環境具有很強的耐受能力, 這種能力與胚胎外部的卵囊和凝膠狀物質的保護有緊密關系。Eyster[19]闡述了卵囊結構與鹽度變化的關系, 發現卵囊外壁可阻斷大分子物質(包括鹽離子)的傳輸, 使卵囊內鹽度環境保持穩定。Woods和DeSilets的研究[20]指出, 凝膠狀物質可減緩鹽分流失。在面對短期鹽度變化時, 卵囊和凝膠狀物質對腹足類胚胎的保護能起到關鍵作用。

圖3　模擬降水對日本菊花螺幼體孵化數的影響Fig. 3 The effect of simulated rainfall on the larval hatching of Siphonaria japonica

表1　卵帶幼體孵化高斯模擬的振幅值統計和獨立樣本t檢驗結果Tab. 1 Summary of the Amplitude Values of the Gaussian simulation of larval hatching of Siphonaria japonica

表2　卵帶幼體孵化高斯模擬的高峰值統計和獨立樣本t檢驗結果Tab. 2 Summary of the Mean Values of Gaussian simulation of larval hatching of Siphonaria japonica

圖4　自然降水對日本菊花螺不同時期卵帶幼體孵化數的影響Fig. 4 The effects of natural rainfall on larval hatching at different stages of Siphonaria japonica

Woods和 DeSilets的研究[20]指出, 后鰓亞綱 Melanochlamys diomedea的卵帶能短期暴露在鹽度為5的海水甚至鹽度為 0的淡水中。Pechenik等[17]的研究發現, 河口區肺螺亞綱Amphibola crenata能在鹽度為5的環境中保持較低的死亡率和正常的孵化率。對新西蘭常見菊花螺屬 Siphonaria australis的研究[18]發現, 其卵帶內胚胎能多次承受鹽度為20的海水的刺激而保持正常的發育和孵化。因此, 日本菊花螺卵帶在遭受到自然降水后, 卵囊和凝膠狀物質可發揮關鍵的保護作用, 保障卵帶內胚胎的正常發育和幼體孵化。

中雨級別的自然降水會加快幼體孵化的速率。在自然降水實驗中, 各時期降水組卵帶單位時間幼體孵化最高值出現的時間點均比相對應的對照組減少了1 d左右, 說明降水組幼體孵化的高峰期提前。這與以往的研究結果不同, 以往研究認為低鹽環境會延長腹足類卵帶內胚胎發育時間, 推遲幼體的孵化[17]。有研究就指出, 對于肺螺亞綱 Amphibola crenata、后鰓亞綱Elysia viridis和3種Doto屬物種,低鹽環境會顯著延長2~3 d卵帶內胚胎發育的時間,推遲幼體孵化時間[19,21-22]。Pechenik等[17]認為這是因為幼體孵化和卵帶瓦解需要化學物質(有可能是酶)參與, 每一個卵囊內幼體孵化時需要鄰近已孵化卵囊中的物質提供協助, 部分幼體滯育或者死亡都可能減緩整個卵帶幼體孵化過程。但同時Pechenik等[17]也指出, 鹽度變化影響卵帶胚胎發育和孵化速率的機制并未完全厘清, 需要在機理方面進行更多研究。因此, 關于本研究中自然降水加快日本菊花螺卵帶幼體孵化速率的機理還需要進一步深入研究。

實驗室內模擬降水對日本菊花螺卵帶胚胎發育和幼體孵化產生了顯著影響。在遭受到模擬降水后,卵帶內部分胚胎發生明顯的滯育現象, 幼體孵化數顯著減少。這表明, 雖然卵囊和凝膠狀物質能在一定程度上保護胚胎, 但卵帶在面對急劇變化的鹽度環境時, 內外滲透壓會失去平衡, 引起胚胎細胞抗氧化能力下降、脂質過氧化[23], 使得胚胎發生滯育甚至會造成畸形, 最終會降低幼體孵化數量[20,24]。降水組卵帶內胚胎的滯育和幼體孵化數的減少并未影響到幼體孵化的速率, 對照組和降水組高斯模擬的高峰值之間不存在顯著差異(P=0.837; 表2)。表明受到模擬降水的影響后, 卵囊和凝膠狀物質仍能保障卵帶內部分胚胎按照正常速率孵化。相似的情況也存在于部分肺螺亞綱生物胚胎發育過程中, A. crenata的胚胎在卵囊和凝膠狀物質的保護下, 能夠在鹽度為10的海水中保持正常的孵化速率[17]。

實驗室模擬降水與自然降水對日本菊花螺卵帶幼體孵化的影響存在明顯差異。實驗室內模擬降水顯著減少卵帶幼體孵化數量, 但并未影響幼體孵化速率; 自然降水對卵帶幼體孵化數量并沒有顯著影響, 但加快了卵帶幼體孵化速率。產生這種差異的原因主要包括以下方面: 模擬降水實驗中的卵帶來自實驗室暫養的成體, 暫養的成體與自然環境下的成體之間生理狀態可能存在差異, 這可能會影響到卵帶和胚胎的狀態[10]; 模擬降水的雨量超過暴雨級別(大于 50 mm/h), 原位實驗中的自然降水只有中雨級別,降水量的差異對卵帶胚胎發育和孵化可能產生不同的影響。在以后的研究中, 我們會進一步探索不同降水量對日本菊花螺卵帶胚胎發育和孵化產生的影響。

圖5　2013年—2017年日本菊花螺繁殖季節有效降水數據統計Fig. 5 Effective precipitation in breeding season of Siphonaria japonica from 2013 to 2017

降水帶來的鹽度變化是影響日本菊花螺繁殖和種群動態的重要因素。對于廈門地區2013年—2017年日本菊花螺繁殖季節(2~5月)有效降水統計的結果顯示(圖5), 每年有效降水時長達150.5~274 h, 時間在38~57 d之間, 平均每2~4 d發生1次有效降水, 有效降水發生頻率較高。其中對潮間帶鹽度變化影響較大的強降雨天氣(中雨以上)較多出現在4月與5月,可能對日本菊花螺胚胎和幼體發育產生重要影響。此外, 對廈門百年來降水量變化特征分析結果顯示,全年降水量呈現明顯的上升趨勢[25]。Walther等[26]指出, 我國東南沿海的年降水量在上個世紀后期的30年中增加了近10%。降水量增加可能會加重降水對潮間帶貝類發育及種群動態的影響。

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