雌雄波紋巴非蛤不同組織中總類胡蘿卜素含量比較分析

李慶昌, 鄧素貞, 劉賢德, 曾志南

(1. 農業部東海海水健康養殖重點實驗室, 集美大學水產學院, 福建 廈門 361021; 2. 福建省水產研究所, 福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室, 福建 廈門 361013)

波紋巴非蛤(Paphia undulata)屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱(Lamellibranchia)、簾蛤目(Veneroida)、簾蛤科(Veneridae)、巴非蛤屬(Paphia), 營埋棲生活, 俗稱“油蛤”, 主要分布于中國福建、廣東、廣西等沿海地區以及日本、澳大利亞、菲律賓等國家和地區, 生活在水深 0.5~3.5m的潮下帶淺海軟泥中[1-2]。波紋巴非蛤對環境適應能力強, 生長周期比較短, 其肉質細嫩、味道鮮美而且營養價值較高, 因而受到廣大消費者的喜愛, 是中國東南沿海著名的海產經濟貝類之一。近年來, 波紋巴非蛤的養殖面積不斷擴大,至 2011年, 福建省漳州市東山灣和詔安灣自然海區增養殖面積已超過4500 hm2, 年產量超過10萬t, 年創產值8.4 億元, 是當地重要支柱產業[3-4]。

類胡蘿卜素是一類天然脂溶性化合物的總稱,自1928年Karrer等[5]首次闡明了β-胡蘿卜素的結構以來, 到目前已經報道了800多種。類胡蘿卜素在人體內的代謝物包括視黃醛、視黃醇等[6]。研究表明類胡蘿卜素在增強人體的免疫功能等方面有很重要的作用, 如預防心血管疾病、老年性黃斑病變、癌癥、骨質疏松癥及眼疾等[7-9]。對水產動物而言, 類胡蘿卜素主要起到改善卵質、減少胚胎發育死亡率、著色等功能[10-11]。已有研究表明, 類胡蘿卜素廣泛存在于多板綱、腹足綱、雙殼綱、頭足綱等海產貝類中, 特別是牡蠣、扇貝、貽貝等雙殼綱中含量更高[12-14]。但由于貝類體內缺乏相應的酶系, 自身不能合成類胡蘿卜素, 其體內豐富的類胡蘿卜素來自于所攝食的含有類胡蘿卜素的藻類或者微生物, 經代謝吸收,最后富集在體內[15]。在蝦夷扇貝[16](Patinopecten yessoensis)、華貴櫛孔扇貝[17](Chlamys nobilis)、三角帆蚌[18](Hyriopsis cumingii)以及馬氏珠母貝[5](Pinctada martensii)中已有類胡蘿卜素的相關報道, 本課題組前期分析了波紋巴非蛤斧足顏色與總類胡蘿卜素含量的關系[19], 而有關雌雄不同組織總類胡蘿卜素含量的研究至今未見報道。

基于此, 本研究對波紋巴非蛤斧足、外套膜、鰓、閉殼肌、性腺五個組織的總類胡蘿卜素含量進行分析, 并對各組織的性別差異情況進行比較, 以期了解波紋巴非蛤體內總類胡蘿卜素含量的分布規律,為波紋巴非蛤品質鑒定、營養成分分析、加工利用與遺傳育種研究提供一定基礎資料。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

本研究所用波紋巴非蛤取自福建省云霄縣礁美海區, 該海區是波紋巴非蛤的主要養殖區, 以海洋牧場的形式進行養殖, 即每年從廣西海區采集天然苗種, 然后放流到該海區進行養殖。本實驗樣品采集時間為2016年12月份, 平均規格為: 殼長(45.68±2.74)mm、殼寬(24.75±4.38)mm、殼高(15.96±1.10)mm、體質量(7.90±1.24)g。

1.2　方法

1.2.1波紋巴非蛤雌雄鑒別

采用鏡檢法鑒定波紋巴非蛤的雌雄。取少許波紋巴非蛤的性腺涂在事先滴有一滴純水的載玻片上,直接放在顯微鏡(Olympus BX-53)下觀察。

1.2.2取樣

隨機選取雌雄波紋巴非蛤樣品各30個, 打開殼后用剪刀和手術刀剪取斧足、外套膜、鰓、閉殼肌和性腺組織。

1.2.3總類胡蘿卜素的提取

總類胡蘿卜素提取方法參閱楊葉欣等[20]的研究并略有改動, 具體方法步驟如下: (1)稱取波紋巴非蛤各組織0.1 g左右, 加入等量的無水硫酸鈉和適量的無水乙醇(分析純)充分勻漿; (2)將勻漿液用無水乙醇潤洗兩次勻漿管, 一并轉移到 10 mL離心管中, 加無水乙醇定容至 8 mL, 用錫箔紙避光密封, 在 4℃冰箱過夜; (3)用4500 r/min低溫離心10 min (Centrifuge 5430R, Eppendorf 公司), 取上清液; (4)用紫外分光光度計(UV-1200, MAPADA)測定在480 nm處的吸光值, 代入公式算出總類胡蘿卜素含量。總類胡蘿卜素質量比(μg/g)=A480×K×V/E1%1cm×G, 其中: A480為 480 nm處吸光度值, K為常數(104), V為提取液體積(mL),E1%1cm為1 cm光程的比色杯中1 g/L質量濃度溶質的理論吸收值(2500), G為樣品質量(g)。

1.3　數據處理

采用EXCEL 2013和SPSS 22.0軟件進行數據統計分析。數據結果以平均值±標準誤(Mean±SE)表示,P<0.05表示有顯著性差異, P<0.01表示有極顯著性差異, P>0.05表示無顯著性差異。

2　結果與分析

2.1　波紋巴非蛤雌雄鑒定結果

將波紋巴非蛤性腺組織處理后在顯微鏡下觀察,雌性的個體在 10倍鏡下可以看到大大的圓形或者橢圓形的卵細胞, 雄性個體在 10倍鏡下只能看到沙粒般點狀物質, 看不到具體的細胞狀物質(如圖 1所示)。

圖1　波紋巴非蛤雌雄鑒定Fig. 1 The gender identification of P.undulata

2.2　波紋巴非蛤不同組織總類胡蘿卜素含量的比較分析

對 60個波紋巴非蛤的斧足(Fo)、外套膜(Ma)、鰓(Gi)、閉殼肌(Ad)及性腺(Go)5個組織總類胡蘿卜素含量進行測量, 然后按照總的(不分雌雄)、雌性、雄性進行各組織類胡蘿卜素含量比較, 結果如表 1所示。總的來講, 各組織總類胡蘿卜素的含量從大到小依次為: 斧足>性腺>外套膜>鰓>閉殼肌, 除了外套膜與鰓之間沒有顯著性差異外(P>0.05), 其他各組織之間均存在極顯著差異(P<0.01), 其中斧足中的含量最高, 為(15.91±0.62)μg/g, 閉殼肌中含量最低, 為(3.05±0.32)μg/g。雌、雄各組織中總類胡蘿卜素含量的分布基本一致, 但在雄性鰓中的含量要大于外套膜中的含量, 雌性個體正好相反。

2.3　波紋巴非蛤各組織總類胡蘿卜素含量雌、雄比較結果

波紋巴非蛤的斧足(Fo)、外套膜(Ma)、鰓(Gi)、閉殼肌(Ad)及性腺(Go)5種組織的雌雄檢測結果如表1所示。雌雄在各組織的差異比較如圖2所示, 結果顯示, 除了性腺之外, 各組織之間總類胡蘿卜素含量沒有顯著性差異(P>0.05), 精巢中類胡蘿卜素含量要顯著高于卵巢。

表1　波紋巴非蛤不同組織總類胡蘿卜素含量差異比較結果Tab. 1 Comparing results of the total carotenoid content in different tissues of P.undulata (μg/g, Mean±SE)

圖2　波紋巴非蛤各組織總類胡蘿卜素含量雌、雄比較結果Fig. 2 Comparing the total carotenoid content in different tissues in male and female P.undulata

3　討論

已有研究表明, 不同貝類體內的類胡蘿卜素含量存在很大的差異, 波動范圍大致為 10~140 μg/g,同種貝類不同組織之間總類胡蘿卜素含量也有較大的差異[21-22]。總類胡蘿卜素在華貴櫛孔扇貝性腺中的含量最高(59.90±1.32)μg/g, 在馬氏珠母貝肝胰腺的含量最高(91.39±13.09)μg/g, 在三角帆蚌的肝臟中含量更是高達(134.8±61.7)μg/g[5,17-18], 本研究發現波紋巴非蛤斧足中的含量最高(15.91±4.80)μg/g, 說明總類胡蘿卜素的組織分布存在種的特異性。此外,本研究實驗結果顯示同一組織不同個體之間的總類胡蘿卜素含量有較大的差異, 例如斧足中總類胡蘿卜素含量為(9.10~29.47)μg/g, 而本實驗中采集的波紋巴非蛤樣品均來自于同一自然海區, 生長環境基本一致, 由此作者推測導致此現象的原因可能是由遺傳差異引起的, 這為下一步選育類胡蘿卜素含量高的波紋巴非蛤新品種提供一定的理論依據。

本研究結果表明, 波紋巴非蛤各組織的總類胡蘿卜素含量除性腺之外, 并沒有性別差異, 但精巢中總類胡蘿卜素含量顯著高于卵巢(P<0.05), 這一結果與鄭懷平等[17]在華貴櫛孔扇貝上的研究結果相反,在華貴櫛孔扇貝卵巢中的總類胡蘿卜素含量顯著高于精巢。作者推測造成這種差異的原因可能有兩個:第一種可能是物種特異性, 第二種可能與作者采樣時間有關。一般來說, 分布于閩南海區的波紋巴非蛤繁殖期在5月中旬至10月下旬, 其繁殖高峰有兩次,分別在5月下旬和10 月上旬, 進入11月份后, 生殖活動已基本結束, 此時多數個體性腺萎縮退化[23-24],而本研究樣品采集于12月份, 此時波紋巴非蛤的性腺已經退化, 鄭懷平等[23]的采樣時間是 4月份, 此時華貴櫛孔扇貝已進入繁殖季節, 而類胡蘿卜素具有改善卵質的作用, 作者推測卵巢中的類胡蘿卜素含量較精巢增長的多。有關生理狀態及繁殖季節對波紋巴非蛤體內類胡蘿卜素含量是否有影響及有什么樣的影響還需要進一步深入研究。

4　結論

本研究利用鏡檢法對波紋巴非蛤性別進行了鑒定, 利用分光光度法對雌雄波紋巴非蛤 5個組織的總類胡蘿卜素含量進行檢測分析, 結果發現波紋巴非蛤的總類胡蘿卜素含量存在組織、性別與個體差異: 不同組織中總類胡蘿卜素含量不同, 精巢中總類胡蘿卜素含量大于卵巢, 同種性別相同組織不同個體之間也有較大的變異, 推測可能與波紋巴非蛤不同個體積累類胡蘿卜素的能力不同有關。本研究初步揭示了波紋巴非蛤體內總類胡蘿卜素含量的分布情況, 為深入研究類胡蘿卜素在波紋巴非蛤體內的代謝富集以及類胡蘿卜素未知功能的探索提供一定的基礎數據, 也為下一步波紋巴非蛤優良品種的選育提供了參考依據。

參考文獻:

[1] 蔡明夷, 郭洋, 柯才煥, 等. 波紋巴非蛤染色體核型分析[J]. 廈門大學學報(自然科學版), 2012, 51(5):935-938.Cai Mingyi, Guo Yang, Ke Caihuan, et al. Karyotype Analysis on Paphia undulata[J]. Journal of Xiamen University(Natural Science), 2012, 51(5): 935-938.

[2] 齊鐘彥. 中國經濟軟體動物[M]. 北京: 中國農業出版社, 1998.Qi Zhongyan. Economic mollusca of China[M]. Beijing:Agricultural Press, 1998.

[3] 方鎮熔. 波紋巴非蛤人工育苗技術[J]. 福建水產,2011, 33(1): 59-62.Fang Zhenrong. Paphia undulata artificially seedling techniques[J]. Journal of Fujian Fisheries, 2011, 33(1):59-62.

[4] 陳何東. 波紋巴非蛤大規格苗種培育技術[J]. 中國水產, 2015(5): 62-63.Chen Hedong. The large-scale seed breeding technology of Paphia undulata[J]. China Fisheries, 2015(5): 62-63.

[5] 吳小芬, 雷超, 陳思曼, 等. 馬氏珠母貝養殖群體兩種規格個體的類胡蘿卜素含量比較[J]. 廣東海洋大學學報, 2016, 36(1): 31-34.Wu Xiaofen, Lei Chao, Chen Siman, et al. Total carotenoid content in soft tissues of two-sized groups in pearl oyster Pinctada martensii stock[J]. Journal of Guangdong Ocean University, 2016, 36(1): 31-34.

[6] 何強強, 惠伯棣, 宮平, 等. 類胡蘿卜素代謝物的生物學活性研究進展[J]. 食品科學, 2011, 32(15): 289-295.He Qiangqiang, Hui Bodi, Gong Ping, et al. Research Progress in Bioactivities of Carotenoid Metabolites[J].Food Science, 2011, 32(15): 289-295.

[7] Yagi A, Fujimoto K, Michihiro K, et al. The effect of lutein supplementation on visual fatigue: a psychophysiological analysis.[J]. Applied Ergonomics, 2009,40(6): 1047-1054.

[8] LaRowe T L, Snodderly D M, Wooten B, et al. Macular lutein (L) and zeaxanthin (Z) density and age-related maculopathy (ARM) in the carotenoids in age-related eye disease study (CAREDS), an ancillary study of the women’s health initiative (WHI)-observational study[C].BETHESDA: FASEB Journal, 2005, 19(5): A986-A986.

[9] Rao A V, Rao L G. Carotenoids and human health (Review)[J]. Pharmacological Research, 2007, 55(3): 207-216.

[10] 高前欣. 水產動物中類胡蘿卜素的生理功能[J]. 中國飼料, 2005(11): 29-30.Gao Qianxin. Physiological functions of carotenoids in aquatic animal[J]. China Feed, 2005(11): 29-30.

[11] 劉金海, 王安利, 王維娜, 等. 水產動物體色色素組分及著色劑研究進展[J]. 動物學雜志, 2002, 37(3):92-96.Liu Jinhai, Wang Anli, Wang Weina, et al. Progress of Study on the Component of Pigment and Painting Substance of Aquatic Animals[J]. Chinese Journal of Zoology, 2002, 37(3): 92-96.

[12] Ackman R G. Marine biogenic lipids, fats, and oils[M].Boca Raton, FL: CRC Press, 1989.

[13] 張倩, 鄭懷平, 劉合露, 等. 海產貝類體內類胡蘿卜素的研究進展[J]. 海洋通報, 2011, 30(1): 108-112.Zhang Qian, Zheng Huaiping, Liu Helu, et al. Research progress of carotenoids in marine mollusks[J]. Marine Science Bulletin, 2011, 30(1): 108-112.

[14] 李慶昌, 劉坦, 陳小明, 等. 織錦巴非蛤斧足顏色與總類胡蘿卜素含量相關分析[J]. 海洋科學, 2016,40(10): 120-125.Li Qingchang, Liu Tan, Chen Xiaoming, et al. Correlation analysis of the color and total carotenoid content in Paphia textile foot tissue[J]. Marine Sciences, 2016,40(10): 120-125.

[15] Britton G, Liaaen-Jensen S, Pfander H. Carotenoids.Volume 1A: Isolation and analysis[J]. Carotenoids,1995, 26: 197-243.

[16] 李寧. 蝦夷扇貝橘紅色閉殼肌產生的原因及其在育種中的應用[D]. 青島: 中國海洋大學, 2009.Li Ning. What accounting for orange color of Yesso scallop muscle (Patinopecten yessoensis) and its application in breeding [D]. Qingdao: Ocean University of China, 2009.

[17] Zheng H, Liu H, Tao Z, et al. Total carotenoid differences in scallop tissues of Chlamys nobilis (Bivalve:Pectinidae) with regard to gender and shell colour[J].Food Chemistry, 2010, 122(4): 1164-1167.

[18] 聞海波, 聶志娟, 曹哲明, 等. 不同顏色珍珠層的三角帆蚌組織中類胡蘿卜素含量的分析[J]. 大連海洋大學學報, 2012, 27(3): 265-268.Wen Haibo, Nie Zhijuan, Cao Zheming, et al. Carotenoid levels in soft tissues of triangle pearl mussel Hyriopsis cumingii with different color nacreous layer[J].Journal of Dalian Fisheries University, 2012, 27(3):265-268 .

[19] 李慶昌, 劉坦, 陳小明, 等. 波紋巴非蛤斧足顏色與總類胡蘿卜素含量的相關分析[J]. 漁業研究, 2017,39(1): 15-21.Li Qingchang, Liu Tan, Chen Xiaoming, et al. Correlation analysis of foot color and total carotenoid content in Paphia undulata [J]. Journal of Fisheries Research,2017, 39(1): 15-21.

[20] 楊葉欣, 顧黨恩, 牟希東, 等. 常用萃取劑提取福壽螺卵中類胡蘿卜素的初步研究[J]. 生物安全學報,2012, 21(4): 291-294.Yang Yexin, Gu Dangen, Mu Xidong, et al. Total carotenoids in the eggs of the golden apple snail, Pomacea canaliculata[J]. Journal of Biosafety, 2012, 21(4):291-294.

[21] Kantha S S. Carotenoids of edible mollusks; a review[J].Journal of food biochemistry, 1989, 13(6): 429-442.

[22] 石婧, 顧賽麒, 王錫昌. 水產動物組織中類胡蘿卜素的研究進展[J]. 食品工業科技, 2014, 35(12): 373-377.Shi Jing, Gu Saiqi, Wang Xichang. Research progress in carotenoids in aquatic animal[J]. Science and Technology of Food Industry, 2014, 35(12): 373-377.

[23] 徐小偉. 波紋巴非蛤早期發育及遺傳多樣性研究[D].福建: 廈門大學, 2015.Xu Xiaowei. Studies on early development stages and genetic diversity of Paphia undulate[D]. Fujian: Xiamen University, 2015.

[24] 趙志江, 李復雪, 柯才煥. 波紋巴非蛤的性腺發育和生殖周期[J]. 水產學報, 1991, 1: 1-8.Zhao Zhijiang, Li Fuxue, Ke Caihuan. On the sex gonad development and reproductive cycle of clam paphia undulata[J]. Journal of Fisheries of China, 1991, 1: 1-8.