4種殼色蛤仔TYR基因的表達特性研究

姜力文, 聶鴻濤, 李東東, 霍忠明, 李妹妍, 閆喜武

(大連海洋大學 水產與生命學院, 遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心, 遼寧 大連 116023)

菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)是我國重要經濟貝類之一。據(jù)聯(lián)合國糧食與農業(yè)組織(FAO)顯示, 2016年全世界蛤仔產量約400萬t, 我國大陸沿海養(yǎng)殖蛤仔產量約占 90%[1]。在海產經濟貝類中, 殼色的繽紛多彩倍受人們關注, 人們更愿意選擇色彩豐富的貝類, 隨之提高其經濟價值, 以殼色為目標性狀進行定向選育, 對貝類遺傳育種有重要指導意義。

酪氨酸酶(單酚, DOPA; 氧化還原酶, tyrosinase,E.C.1.14.18.1)是一種含銅金屬酶, 主要作用酪氨酸酶催化酪氨酸氧化成多巴, 多巴氧化形成多巴醌反應, 同時多巴醌能自發(fā)地相互反應或與氨基反應,使相關蛋白相互交聯(lián), 形成具有化學惰性的深色不溶性蛋白聚合物[2-4], 在哺乳動物酪氨酸酶催化產生的黑色素被分泌進入到表皮和毛發(fā)的角質細胞中,使體表著色, 從而起保護皮膚和眼睛、抵御紫外線的輻射和防止內部組織過熱等作用[5]。在雙殼類動物中TYR基因的研究也一直在進行, 在牡蠣的4種殼色研究中表明酪氨酸酶與金色殼色形成有關[6]。目前在扇貝研究中報道, 酪氨酸酶家族可能參與生物礦化和黑色素的生物合成[7]。Yu等[8]克隆了長牡蠣的酪氨酸酶基因, 并對其各個組織中的表達量進行分析, 研究表明酪氨酸酶在色素帶中的含量最多。Huan等[9]在長牡蠣稚貝中克隆和分析了酪氨酸酶表達, 表明酪氨酸酶可能參與早期幼蟲殼的形成。井巖[10]克隆獲得文蛤 TYR基因 cDNA全長, 并利用熒光定量PCR(Polymerase Chain Reaction, PCR)的方法對4種不同殼色文蛤中 TYR基因的表達差異進行分析, 表明 TYR基因在黑殼中表達量最高, 為以后利用殼色作為遺傳標記進行品種改良與雜交育種提供理論基礎。在合浦珠母貝傷口愈合過程中, 酪氨酸酶均在外套膜中特異性表達, 推測參與了角質層及外殼柱狀層形成[11]。其中最主要的是酪氨酸酶控制黑色素細胞的活性, 是黑色素合成的關鍵酶之一[12]。在菲律賓蛤仔中, 還未有對TYR基因表達特性的報道。

本實驗通過二代測序得到菲律賓蛤仔TYR基因,并對不同殼色蛤仔及不同組織進行相對定量分析,分析不同殼色蛤仔 TYR基因的表達特性, 以期揭示色素控制基因與殼色及組織之間關系, 為下一步深入研究其不同殼色表達機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

實驗采用 4種殼色菲律賓蛤仔, 分別為: 斑馬蛤(Z)、白斑馬蛤(WZ)、白蛤(W)和橙蛤(O)。2005年從福建莆田野生菲律賓蛤仔群體中采用選育技術, 經過連續(xù)7代選育而成。獲得具有穩(wěn)定性狀的個體。采自瓦房店養(yǎng)殖場基地殼長20.0 mm±0.5 mm。在實驗室中暫養(yǎng)2周, 每種殼色取3個個體作為生物學重復, 對每個個體的7種不同組織分別進行分析。7種組織分別為:鰓、外套膜、閉殼肌、唇瓣、水管、性腺和消化腺。

1.2　序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構建

取約 0.03 g組織, 利用試劑盒海洋動物組織總RNA提取試劑盒(天根)提取樣本總 RNA, 并在提取過程中用 RNase-Free DNase Set(天根)去除DNA。檢測總RNA濃度后, 利用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒進行反轉錄。根據(jù)菲律賓蛤仔TYR基因保守區(qū)域使用Primer Premier 5.0設計引物進行擴增, PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒 (Axygen Bioscience)純化, 送到公司(上海生工)測序。利用Clustal X 2將蛤仔TYR蛋白序列與現(xiàn)有GenBank中的TYR蛋白序列進行完全比對分析[13], 然后用MEGA 5.05[14]以鄰接法 (Neighbor-Joining, NJ)和Poisson模型構建系統(tǒng)發(fā)育樹, 設置 Bootstrap重復分析1 000次[15]。

1.3　TYR基因相對定量分析和數(shù)據(jù)處理

根據(jù)菲律賓蛤仔TYR基因序列設計熒光定量擴增引物 (表1)。以β-actin為內參基因, 檢測4種殼色菲律賓蛤仔以及不同組織中TYR基因的表達水平。用TaKaRa SYBR Green Premix Ex TaqTM||試劑盒。在羅氏熒光定量PCR儀上進行反應, 實驗設3個平行樣品。熒光定量采用兩步法, PCR程序: 94℃ 30 s,94℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40 個循環(huán); 溶解。用 2–ΔΔCt法處理各基因熒光定量所得數(shù)據(jù), 并用SPSS17.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA), 當 P<0.05時, 表示差異顯著。

表1　TYR基因熒光定量引物Tab. 1 Primers used in TYR quantitative real-time PCR

2　結果

2.1　菲律賓蛤仔TYR基因序列多重比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

使用 Clustal X 2軟件將測序結果與其他物種TYR基因進行多序列比對, 其中測序得到的TYR3基因為280 bp, TYR10基因為750 bp。實驗測序所得到的序列與之前設計引物的序列一致。發(fā)現(xiàn) TYR3與TYR10的同源性為48%。TYR3與馬氏珠母貝(Pinctada martensii)同源性最高為 64%, 其次為大珠母貝(Pinctada maxima)為63%。TYR10與加州雙斑蛸(Octopus bimaculoides)同源性最高, 為53%, 其次為大珠母貝(Pinctada maxima)為51%。均具有同源性(圖1)。

圖2為 TYR基因進化樹。由圖可知, 菲律賓蛤仔的TYR3與TYR10最先聚為一支, 菲律賓蛤仔與長牡蠣進化關系最近, 遺傳距離最小, 最先聚為一支,再與珠母貝和合浦珠母貝聚為一支, 然后與其余貝類聚為一支, 最后再與脊椎動物聚為一大支。

圖1　菲律賓蛤仔TYR3和TYR10與其他物種 TYR 氨基酸序列多序列比對Fig. 1 Multiple alignment of the TYR3 and TYR10 amino acid sequence between Ruditapes philippinarum and other species

2.2　TYR基因在不同組織中的表達模式

TYR2基因在蛤仔7種組織中均有表達, 在鰓、外套膜、閉殼肌、唇瓣、性腺、內臟團以及水管的表達量不盡相同(圖 3)。TYR2基因在橙蛤的外套膜中表達量最高, 除白蛤外其他殼色的外套膜表達量也較高,與其他組織表達量差異顯著(P < 0.05)。鰓和唇瓣表達量次之。總體來說, TYR2基因在不同殼色蛤仔的7個組織中表達量最高的為外套膜, 閉殼肌中表達量最低。

2.3　TYR基因在四種殼色蛤仔外套膜中的表達模式

菲律賓蛤仔TYR基因在4種殼色外套膜中的表達量如圖4所示。不同TYR基因在4種殼色中均有表達。TYR2、TYR3、TYR6和TYR9基因均在白斑馬蛤仔殼色中有較高表達, 同時與斑馬蛤和白蛤均差異顯著(P < 0.05)。TYR2、TYR6、TYR9、TYR10 和TYR11基因均在橙蛤中表達量較高, 其中 TYR2,TYR6和TYR10在橙蛤中表達量最高, 同時與斑馬蛤和白蛤均差異顯著(P < 0.05)。TYR11在斑馬蛤中表達量最高, 與白斑馬蛤和斑馬蛤殼色差異顯著(P <0.05)。(圖 4)。

3　討論

圖2　菲律賓蛤仔 TYR3和TYR10與其他物種TYR 氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of the TYR amino acid sequences between R. philippinarum and other species

圖3　菲律賓蛤仔不同殼色TYR2基因在7種組織的表達量Fig. 3 Expression of TYR2 in seven tissues of four shell color strains of Manila clam

在貝類的發(fā)育過程中, 外套膜外表皮細胞中色素細胞不斷分泌色素顆粒, 色素顆粒通過微絨毛到達外套膜的表面聚集形成色素帶, 從而能夠在貝殼的表面形成不同的顏色花紋[16-17]。菲律賓蛤仔外套膜位于左右貝殼內面, 從軟體部背側向腹側伸展,將內臟團, 鰓等包圍起來。本研究發(fā)現(xiàn) 6個 TYR基因在不同殼色外套膜中具有不同的表達特性, 可能是由于菲律賓蛤仔復雜的花紋, 在不同的殼色性狀中, 都有黑色素合成過程。進一步驗證酪氨酸酶與黑色素形成的關系。不同TYR基因在4種殼色中均有表達。TYR2、TYR3、TYR6和TYR9基因均在白斑馬蛤外套膜中有較高表達, 白斑馬蛤作為斑馬蛤和白蛤的雜交后代, 具有抗逆性強等雜種優(yōu)勢[18]。TYR基因在白斑馬蛤中高表達可能由于雜種優(yōu)勢, 與免疫調節(jié)相關。Mu?oz等[19]研究發(fā)現(xiàn), 用寄生蟲感染3種雙殼類, 發(fā)現(xiàn)感染組的血淋巴以及血細胞中酪氨酸活性比對照組顯著增加, 證明了酪氨酸酶參與了貝類天然免疫反應。在哺乳動物中, 褐黑色素能使毛發(fā)或皮膚表現(xiàn)為黃色和紅色, 真黑素表現(xiàn)為褐色和黑色, 它們的相對數(shù)量與分布決定了顏色深淺等多種表型[20-21]。橙蛤作為一種特殊的顏色性狀, TYR2、TYR6、TYR9、TYR10和TYR11基因均在橙蛤中表達量較高, 推測酪氨酸酶可能與橙蛤中橙色的形成有關。這與之前酪氨酸酶基因在金色牡蠣中表達量高的結果相似[11]。但酪氨酸酶在非黑色素細胞的作用尚不明確, 仍需進一步研究。TYR11在斑馬蛤中表達 量最高, 可能與背景色形成有關。

圖4　 不同TYR基因在4種殼色蛤仔外套膜中的表達量Fig. 4 Analysis of expression difference of different TYR gene in the mautle of different shell colors of Ruditapes philippinarum

TYR基因在蛤仔7種組織中表達量有顯著差異,TYR2基因在外套膜和鰓中表達量較高, 可能與不同組織的功能有關。外套膜不斷分泌色素及殼形成相關成分, 鰓除了呼吸濾水外, 也是主要的免疫器官,可以調節(jié)自身免疫, TYR基因也有可能參與了免疫調節(jié)作用, 在其他物種中已被驗證[22-23]。酪氨酸酶基因除黑色素形成機制外, 與免疫, 生長等都有密切聯(lián)系。在光滑雙臍螺卵塊中檢測到了酪氨酸酶活性, 說明與卵泡形成有著密切關系[24]。同時在貝類足絲中也發(fā)現(xiàn)了酪氨酸酶的存在, 說明酪氨酸酶與軟體動物足絲形成有關[25]。

綜上, 本實驗利用實時熒光定量 PCR研究了TYR基因在不同殼色蛤仔和不同組織中的表達特性,驗證酪氨酸酶基因與黑色素形成的關系, 同時推測了酪氨酸酶基因與非黑色素形成的關系, 以及不同組織中酪氨酸酶基因表達量的變化。為進一步對菲律賓蛤仔殼色的遺傳機制研究提供參考。

參考文獻:

[1] FAO. Global production statistics: Ruditapes philippinarum [EB/OL]. [2016-12-14]. http: //www.fao.org/fishery/species/3543/en

[2] Waite J H. Quinone-Tanned Scleroproteins[M]. New York: Academic Press. 1983.

[3] And T L H, Kramer K J. Insect cuticle sclerotization[J].Entomology, 1992, 37(37): 273-302.

[4] Kramer K J, Kanost M R, Hopkins T L, et al. Oxidative conjugation of catechols with proteins in insect skeletal systems[J]. Tetrahedron, 2001, 57(2): 385-392.

[5] 陳清西, 宋康康. 酪氨酸酶的研究進展[J]. 廈門大學學報(自然版), 2006, 45(5): 731-737.Chen Qingxi, Song Kangkang. Tyrosinase: recent prospects[J]. Journal of Xiamen University (Natural Science), 2006, 45(5): 731-737.

[6] Feng D, Li Q, Yu H, et al. Comparative transcriptome analysis of the Pacific Oyster Crassostrea gigas characterized by shell colors: identification of genetic bases potentially involved in pigmentation[J]. Plos One, 2015,10(12): e0145257.

[7] Sun X, Yang A, Wu B, et al. Characterization of the mantle transcriptome of yesso scallop (Patinopecten yessoensis): identification of genes potentially involved in biomineralization and pigmentation[J]. Plos One,2015, 10(4): e0122967.

[8] Yu X, Yu H, Kong L F, et al. Molecular cloning and differential expression in tissues of a tyrosinase gene in the Pacific oyster Crassostrea gigas[J]. Molecular Biology Reports, 2014, 41(8): 5403-5411.

[9] Huan P, Liu G, Wang H X, et al. Identification of a tyrosinase gene potentially involved in early larval shell biogenesis of the Pacific oyster Crassostrea gigas[J]. Development Genes and Evolution, 2013,223(6): 389-394.

[10] 井巖. 文蛤 SNP位點的開發(fā)和酪氨酸酶基因的克隆及表達分析[D]. 寧波: 浙江萬里學院, 2015.Jing Yan. The development of SNP and the clone and expression anlysis of tyrosinase gene in hard clam Meretrix meretrix[D]. Ningbo: Zhejiang Wanli University, 2015.

[11] Zhang C, Xie L, Huang J, et al. A novel putative tyrosinase involved in periostracum formation from the pearl oyster (Pinctada fucata) [J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2006, 342(2):632-639

[12] Mason H S. Oxidases[J]. Annual Review of Biochemistry,1965, 34(34): 595.

[13] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, et al. Clustal W and Clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics, 2007,23(21): 2947-2948.

[14] Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5:Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731-2739.

[15] Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap[J]. Evolution, 1985, 39(4):783-791.

[16] 張安國, 李太武, 蘇秀榕, 等. 不同花紋文蛤外套膜的顯微及亞顯微結構的初步研究[J]. 水產科學, 2011,30(3): 132-135.Zhang Anguo, Li Taiwu, Su Xiurong, et al. Microstructure and ultrastructure of mantle in clam Meretrix meretrix linnaeus with various decorative patterns[J].Fisheries Science, 2011, 30(3): 132-135.

[17] Simkiss K, Wilbur K M. Biomineralization: cell biology and mineral deposition[J]. Quarterly Review of Biology, 1989, 1(3): 257-264.

[18] 閆喜武, 張躍環(huán), 孫煥強, 等. 菲律賓蛤仔兩道紅與白斑馬品系的三元雜交[J]. 水產學報, 2010, 34(8):1190-1197.Yan Xiwu, Zhang Yuehuan, Sun Huanqiang, et al. Three way crosses between two-band red and white zebra strains of Manila clam, Ruditapes philippinarum[J]. Journal of Fisheries of China, 2010, 34(8): 1190-1197.

[19] Mu?oz P, Meseguer J, Esteban M A. Phenoloxidase activity in three commercial bivalve species. Changes due to natural infestation with Perkinsus atlanticus [J].Fish & Shellfish Immunology, 2006, 20(1): 12-19.

[20] Venizelos A, Benetti D D. Pigment abnormalities in flatfish [J]. Aquaculture, 1999, 176(176): 181-188.

[21] 孟浩浩, 許瑞霞, 代蓉, 等. 綿羊黑色素合成相關基因的研究進展[J]. 生物技術通報, 2014, 8: 34-39.Meng Haohao, Xu Ruixia, Dai Rong, et al. Research progress of genes related to melanin synthesis in sheep[J]. Biotechnology Bulletin, 2014, 8: 34-39.

[22] Naraoka T, Uchisawa H, Mori H, et al. Purification,characterization and molecular cloning of tyrosinase from the cephalopod mollusk, Illexargentinus[J]. European Journal of Biochemistry, 2003, 270(19): 4026-4038.

[23] Asokan R, Arumugam M, Mullainadhan P. Activation of prophenoloxidase in the plasma and haemocytes of the marine mussel Perna viridis Linnaeus [J]. Developmental & Comparative Immunology, 1997, 21(1): 1.

[24] Bai G, Brown J F, Watson C, et al. Isolation and characterization of phenoloxidase from egg masses of the gastropod mollusc, Biomphalaria glabrata [J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology, 1997, 118(2): 463.

[25] Waite J H, Tanzer M L. The bioadhesive of Mytilus byssus: a protein containing L-dopa[J]. Biochemical &Biophysical Research Communications, 1980, 96(4): 1554.