葛根素聯(lián)合替米沙坦對肥胖性高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR/NF-κB炎癥信號通路的影響

郭亞東 邢占良 舒寶瑞 劉春玲 賈子雷

葛根素聯(lián)合替米沙坦對肥胖性高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR/NF-κB炎癥信號通路的影響

郭亞東 邢占良 舒寶瑞 劉春玲 賈子雷

目的 觀察葛根素聯(lián)合替米沙坦對肥胖性高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞Toll樣受體/核因子-κB(TLR/NF-κB)炎癥信號通路的影響。方法 選取2013年6月至2015年6月診治的肥胖性高血壓患者160例為病例組，另選取同期進(jìn)行健康體檢的正常人100例為正常組。采用Real time-PCR測定2組血管內(nèi)皮細(xì)胞Toll樣受體2(TLR2)、Toll樣受體4(TLR4)mRNA表達(dá)。將160例肥胖性高血壓患者隨機(jī)分為觀察A組和觀察B組，每組80例。觀察A組給予替米沙坦治療，觀察B組在觀察A組基礎(chǔ)上加用葛根素治療，療程1個月。采用Real time-PCR和Western-blot分別測定TLR2、TLR4、NF-κB及其抑制蛋白IκBa mRNA和蛋白表達(dá)。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平變化。 結(jié)果 (1)與對照組比較，肥胖性高血壓患者組TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(2)經(jīng)治療后，觀察A組和觀察B組TLR2、TLR4、NF-κBmRNA和蛋白表達(dá)及TNF-α、IL-6、hs-CRP水平顯著下降，IκBamRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，但觀察組以上指標(biāo)改善程度優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 肥胖性高血壓患者存在明顯的免疫炎性反應(yīng)紊亂，葛根素聯(lián)合替米沙坦能夠明顯下調(diào)TLR/NF-κB炎癥信號通路的激活及炎性因子釋放，進(jìn)而對血管內(nèi)皮損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

葛根素；替米沙坦；肥胖性高血壓；Toll樣受體；NF-κB

肥胖是原發(fā)性高血壓的最主要危險因素之一，近年來我國肥胖性高血壓患病率逐年升高，患者并發(fā)心血管疾病的幾率較單純肥胖或單純高血壓患者明顯升高[1]。肥胖性高血壓的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與胰島素抵抗、交感神經(jīng)過度激活、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥、免疫功能紊亂等有關(guān)，但其確切機(jī)制尚未闡明[2]。Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)是定位于細(xì)胞表面的高度保守的跨膜受體，廣泛分布于單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。TLRs與其配體結(jié)合后通過促進(jìn)核因子-κB(NF-κB)的核轉(zhuǎn)位發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，TLRs與胰島素抵抗、血管內(nèi)皮損傷、免疫炎性反應(yīng)等病理過程密切相關(guān)，其表達(dá)上調(diào)可能對肥胖性高血壓發(fā)病起促進(jìn)作用[3,4]。目前臨床治療肥胖性高血壓的藥物存在肝臟毒性大、效果不佳等缺點，因此尋找安全有效的藥物并探明藥物作用的靶點對于治療該病至關(guān)重要。研究顯示，替米沙坦具有降壓、改善脂質(zhì)代謝等藥理作用，已廣泛應(yīng)用于高血壓的臨床治療中[5]。葛根素是從豆科植物野葛、甘葛中提取的有效成份，具有降壓、抗血小板聚集、保護(hù)心肌細(xì)胞等作用[6]。本研究通過觀察葛根素聯(lián)合替米沙坦對肥胖性高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR/NF-κB炎癥信號通路的影響，旨在探討葛根素聯(lián)合替米沙坦治療肥胖性高血壓的可能機(jī)制，為葛根素在肥胖性高血壓治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年6月至2015年6月我院門診及住院的原發(fā)性高血壓且體重指數(shù)(BMI)≥25 kg/m2患者160例為研究對象，符合2004年《中國高血壓防治指南》制定的高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)，即收縮壓(SBP)≥140 mm Hg，舒張壓(DBP)≥90 mm Hg。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重心、肝、肺、腎等重要臟器功能衰竭者；(2)惡性腫瘤、自身免疫性疾病患者；(3)藥物過敏者；(4)近期服用過減肥藥及降脂藥者；(5)繼發(fā)性高血壓患者。選取同期于我院進(jìn)行健康體檢的正常人100例為對照組。160例患者隨機(jī)分為觀察A組和觀察B組，每組80例。觀察A組男56例，女24例；年齡40～61歲，平均年齡(57.22±9.13)歲；高血壓Ⅰ級20例，Ⅱ級46例，Ⅲ級14例；合并冠心病者22例，合并糖尿病者18例。觀察B組男52例，女28例；年齡38～62歲，平均年齡(55.63±8.76)歲；高血壓Ⅰ級17例，Ⅱ級48例，Ⅲ級15例；合并冠心病25例，合并糖尿病16例。2組年齡、性別比、高血壓分級、合并疾病等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=80

1.2 治療方法 2組治療期間均予以限鹽、控制飲食、戒煙酒、避免過勞，同時給予降壓、調(diào)脂、擴(kuò)血管等常規(guī)藥物治療。觀察A組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予40mg替米沙坦(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司)，1次/d。觀察B組在觀察A組基礎(chǔ)上加用400mg葛根素葡萄糖注射液(青島金峰制藥有限公司)，靜脈滴注，1次/d，療程1個月。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察2組TLR2、TLR4、核因子-κB(NF-κB)、抑制蛋白IκBamRNA和蛋白表達(dá)及血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平變化。

1.4 檢測方法

1.4.1Realtime-PCR:Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書加樣進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，ABI7300型熒光定量PCR儀擴(kuò)增。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用儀器自帶的分析軟件得到各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值，以β-actin為內(nèi)參照基因，目的基因表達(dá)相對值RQ=2ΔΔCt。見表2。

1.4.2Western-blot:提取細(xì)胞總蛋白，半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2h。依次加入特異性一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件掃描測定蛋白條帶IOD值，β-actin作為內(nèi)參照，以目的蛋白與β-actin吸光度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

表2 Real time-PCR引物序列

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA):采用ELISA測定血清TNF-α、IL-6、hs-CRP水平。試劑盒均購自南京建成生物工程技術(shù)研究所，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 健康人和肥胖性高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR2、TLR4mRNA表達(dá)比較Realtime-PCR結(jié)果顯示，對照組和肥胖性高血壓患者組TLR2、TLR4mRNA表達(dá)水平分別為0.69±0.11和4.05±0.60、0.78±0.12和4.13±0.65，觀察組TLR2、TLR4mRNA表達(dá)水平較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 對照組和觀察組血清血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)比較

注：與對照組比較,*P<0.05

2.2 葛根素聯(lián)合替米沙坦對肥胖性高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR2、TLR4mRNA和蛋白表達(dá)的影響 2組治療前TLR2、TLR4mRNA和蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組治療后TLR2、TLR4mRNA和蛋白表達(dá)較治療前有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但觀察B組下降程度優(yōu)于觀察A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4、5。

表4 觀察A組和觀察B組TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)比較

注：與治療前比較,*P<0.05;與觀察A組比較,#P<0.05

表5 觀察A組和觀察B組TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較

注：與治療前比較,*P<0.05;與觀察A組比較,#P<0.05

2.3 葛根素聯(lián)合替米沙坦對肥胖性高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κBmRNA和蛋白表達(dá)的影響 2組治療前NF-κBmRNA和蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組治療后NF-κBmRNA和蛋白表達(dá)較治療前有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但觀察B組下降程度優(yōu)于觀察A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

2.4 葛根素聯(lián)合替米沙坦對肥胖性高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞IκBa mRNA和蛋白表達(dá)的影響 2組治療前IκBa mRNA和蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組治療后IκBa mRNA和蛋白表達(dá)較治療前有所升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但觀察B組升高程度優(yōu)于觀察A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表7。

表6 觀察A組和觀察B組NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)比較

注：與治療前比較,*P<0.05;與觀察A組比較,#P<0.05

表7 觀察A組和觀察B組IκBa mRNA和蛋白表達(dá)比較

注：與治療前比較,*P<0.05;與觀察A組比較,#P<0.05

2.5 葛根素聯(lián)合替米沙坦對肥胖性高血壓患者血清炎性因子的影響 2組治療前TNF-α、IL-6、hs-CRP水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組治療后TNF-α、IL-6、hs-CRP較治療前有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但觀察B組下降程度優(yōu)于觀察A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表8。

表8 觀察A組和觀察B組血清炎性因子比較

注：與治療前比較,*P<0.05;與觀察A組比較,#P<0.05

3 討論

TLRs是一類高度保守的跨膜受體，包括13個家族成員，參與多種信號級聯(lián)反應(yīng)，在胰島素抵抗、免疫炎性反應(yīng)等病理過程中發(fā)揮重要作用，與動脈粥樣硬化、糖尿病、高血壓、代謝綜合征等老年疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。其中TLR4是目前研究最多也是被認(rèn)為和肥胖性高血壓關(guān)系最密切的TLRs家族成員。TLR4通過激活c-Jun-N末端激酶(JNK)、NF-κB等炎癥信號通路抑制胰島素信號蛋白激活導(dǎo)致胰島素抵抗,而胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)可促進(jìn)腎對鈉的重吸收和內(nèi)皮素(ET-1)等血管活性物質(zhì)釋放，并激活腎交感神經(jīng)，從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損及肥胖性高血壓的發(fā)生發(fā)展[10]。研究顯示，TLR4敲除小鼠對高脂引起的肥胖有抵抗作用，同時脂肪組織NF-κB表達(dá)下調(diào)，且未出現(xiàn)高胰島素血癥。此外，TLR4通過調(diào)節(jié)骨骼肌組織丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的活性和脂肪合成控制血糖和血脂水平。以上研究說明TLR4通過多種復(fù)雜機(jī)制參與肥胖性高血壓的發(fā)病[11]。TLR2是在人皮下脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的TLRs家族成員。Davis等[12,13]研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因缺失能夠明顯抑制高脂引起的脂肪細(xì)胞炎性反應(yīng)并促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運，從而改善胰島素敏感性。Monaco等[14]研究發(fā)現(xiàn)，抑制TLR2能夠明顯抑制血管炎性損傷和動脈粥樣硬化斑塊形成，從而對心腦血管病發(fā)揮保護(hù)作用，而TLR2表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)肥胖性高血壓發(fā)病。

本研究通過分析葛根素聯(lián)合替米沙坦對160例肥胖性高血壓患者血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR/NF-κB炎癥信號通路的影響，結(jié)果顯示，肥胖性高血壓患者較正常人TLR2、TLR4mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明肥胖性高血壓患者存在嚴(yán)重的免疫功能紊亂和炎性反應(yīng)。經(jīng)1個月治療后，觀察A組和觀察B組TLR2、TLR4、NF-κBmRNA和蛋白表達(dá)及TNF-α、IL-6、hs-CRP水平顯著下降，IκBamRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，但觀察B組以上指標(biāo)改善程度優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明葛根素聯(lián)合替米沙坦治療肥胖性高血壓患者能夠進(jìn)一步降低TLR2、TLR4mRNA和蛋白表達(dá)，同時NF-κB激活后導(dǎo)致的TNF-α、IL-6、hs-CRP水平顯著下調(diào)。

綜上所述，TLR/NF-κB炎癥信號通路通過促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌和釋放介導(dǎo)免疫炎性反應(yīng)，這是肥胖性高血壓發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制之一。葛根素聯(lián)合替米沙坦治療肥胖性高血壓能夠明顯抑制TLR/NF-κB炎癥信號通路的激活和炎性反應(yīng)，從而對高血壓和高血脂引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。本研究表明葛根素聯(lián)合替米沙坦在肥胖性高血壓治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Effects of puerarin combined with telmisartan on Toll-like receptor/nuclear factor-κB inflammatory signal pathway in patients with obesity hypertension

GUOYadong,XINGZhanliang,SHUBaorui,etal.

People’sHospitalofRenqiuCity,Hebei,Renqiu062550,China

Objective To investigate the effect of puerarin combined with telmisartan on Toll-like receptor/nuclear factor-κB (TLR/NF-κB) inflammatory signal pathway in patients with obesity hypertension.Methods A total of 160 patients with obesity hypertension who were admitted and treated in our hospital from June 2013 to June 2015 were enrolled as case group,and the other 100 healthy subjects were served as normal control group. The expression levels of TLR2 ,TLR4 mRNA in vascular endothelial cells were detected by Real time-PCR.In addition, the patients in case group were randomly redivided into observation group (n=80)andcontrolgroup(n=80).Thepatientsincontrolgroupweretreatedbytelmisartan,however,thepatientsinobservationgroup,onthebasisofcontrolgroup,weregivenpuerarin,withatreatmentcourseofonemonthforbothgroups.Aftertreatment,TheexpressionlevelsofTLR2,TLR4,NF-κBandIκBaatmRNAandproteinweredetectedbyRealtime-PCRandWesternBlot,respectively.FurthermoretheserumlevelsofTNF-α,IL-6andhs-CRPweredetectedbyELISA.Results As compared with those in normal control group,the expression levels of TLR2 and TLR4 mRNA in case group were significantly increased (P<0.05).Aftertreatment,theexpressionlevelsofTLR2,TLR4,NF-κBmRNAandproteinandtheserumlevelsofTNF-α,IL-6,hs-CRPincontrolgroupandobservationgroupweresignificantlydecreased,however,theexpressionlevelsofIκBamRNAandproteininbothgroupsweresignificantlyincreased,ascomparedwiththosebeforetreatment(P<0.05),buttheimprovementdegreeoftheseparametersinobservationgroupwassuperiortothatincontrolgroup(P<0.05).Conclusion The obvious immune inflammatory reaction disorder exists in patients with obesity hypertension. Puerarin combined with telmisartan can obviously down-regulate the activation of TLR/NF-κB inflammatory signal pathway and release of inflammatory factors so us to perform protective effects on vascular endothelial injury.

puerarin; telmisartan; obesity hypertension; Toll-like receptor; NF-κB

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.03.011 ·論著·

062550 河北省任丘市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

R

A

1002-7386(2017)03-0364-04

2016-02-01)