TiN涂層生物活性及成骨誘導性研究

Saran Limbu，李瑞延，張彥博，秦彥國

(吉林大學第二醫院 關節外科，吉林 長春130041)

TiN涂層生物活性及成骨誘導性研究

Saran Limbu，李瑞延，張彥博，秦彥國*

(吉林大學第二醫院 關節外科，吉林 長春130041)

鈦合金因其良好的生物相容性而被廣泛應用于口腔及骨科臨床實踐[1-3]。但鈦合金往往表現出表面生物惰性，骨傳導性差，這一特性導致周圍骨組織難以和植入物材料形成骨性結合，最終造成無菌性松動[4]。

通過對鈦合金表面進行改性可以改變鈦合金本身惰性的這一弊端，促進材料與骨組織直接結合促進骨愈合[5,6]。目前有很多表面改性手段，如酸堿蝕刻、微弧氧化、物理沉積涂層等辦法[7,8]。而表面涂層技術在近些年的研究越發受到重視，因其可以保留原有基底材料的物理性能，又能提高其表面性能。

我們發現氮化鈦(TiN)是一種很好的涂層材料，TiN具有適宜的硬度，優秀抗腐蝕性能和耐磨性能[9-11]。有趣的是TiN會逐步緩慢氧化，隨著O元素的加入，TiN的羥基磷灰石沉積能力得到明顯提高。而在模擬體液中的羥基磷灰石的沉積能力一定程度上反應了材料的成骨活性?；谶@一前提我們假設TiN具有良好的生物活性和成骨活性，并對其進行研究。我們通過磁控濺射技術在鈦合金表面噴涂一層TiN涂層，并通過體外骨髓干細胞培養實驗探究生物相容性及成骨誘導活性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

細胞實驗相關試劑：基礎培養基(低糖DMEM，hygcone)，胎牛血清(FBS，杭州四季青)，胰酶、雙抗(青霉素鈉、鏈霉素)和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購置于美國Gibco公司。掃描電鏡(XL-30 ESEM FEG Scanning Electron Microscope， FEI COMPANY)，酶標儀(Varioskan Flash,Thermo scientific)，細胞培養箱。

1.2 材料制備

使用成分為Ti6Al4V的鈦片(TC4)作為基底，在其表面進行磁控濺射TiN涂層處理。取胎兔骨髓間充質干細胞進行細胞實驗。

1.3 細胞增殖

將鈦片置于24孔板中，每孔接種細胞2萬個，每兩天換液一次，使用CCK-8試劑分別檢測1、4、7天的細胞增殖情況。檢測時CCK-8試劑與培養液比例為1∶10，37℃避光孵育2 h后在450 nm波長下檢測吸光度。

1.4 細胞形貌

鈦片放入24孔板中，細胞在鈦片上培養4天后，用電鏡固定液固定細胞。樣本經梯度乙醇脫水，干燥后進行噴金處理，最終在電鏡下進行觀察拍照。

1.5 細胞活性

制備材料浸提液，當細胞培養至80%融合時加入浸提液培養48 h，含5% DMSO的培養液用作對照，用CCK-8試劑檢測吸光度，對材料對細胞活性的影響進行研究。

1.6 成骨能力檢測

將鈦片置于24孔板中，每孔接種10萬個細胞，培養24 h后將培養液換成成骨誘導培養液，每兩天換液一次。分別在第14天用茜素紅對鈣結節進行染色。染色完成在體視顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 統計學方法

所有實驗數據均獨立重復檢測 3 次，計量資料比較 采用t檢驗，多個樣本的組間比較采用 ANOVA，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖

如圖1所示為骨髓間充質干細胞在TiN和鈦合金表面培養1、4、7天的細胞增殖情況。可見TiN涂層在3個時間點細胞都多于鈦合金組，尤其是在第4、7天，TiN與鈦合金組有統計學差異(P<0.05)。

2.2 細胞黏附

如圖2所示,在TiN涂層及TC4均可看到生長黏附的細胞。TiN涂層表面的細胞較伸展，較TC4組有更多的絲狀偽足伸展，這表明細胞處于活躍的生長遷移狀態[12]。這一結果表明TiN表面更適合骨髓干細胞黏附。

圖1 骨髓干細胞在TiN涂層及鈦合金表面培養1、4、7天的細胞增殖情況

2.3 細胞活性

如圖3所示。TiN和鈦合金組細胞數量較多，與含5% DMSO組對比有統計學差異。這表明TiN和鈦合金均無細胞毒性，具有較好的生物相容性。

2.4 成骨活性

茜素紅染色結果如圖4所示，TiN表面及鈦合金表面均有紅色的鈣結節沉積，而TiN鈣結節數量面積明顯高于鈦合金組。這表明TiN能夠明顯的促進骨髓間充質干細胞的成骨分化。

圖2 細胞在TiN涂層及鈦合金表面的細胞

圖3 材料浸提液的細胞毒性檢測

3 討論

生物材料一直是近些年的研究熱點，同時具有良好生物相容性和成骨活性的材料對于骨科植入物來說至關重要。本研究成功通過磁控濺技術在鈦合金表面制備了TiN涂層。通過細胞增殖實驗，在長達7天的細胞培養過程中，TiN涂層組細胞數量一直高于鈦合金組，我們發現TiN涂層能明顯促進骨髓干細胞的增殖。在細胞黏附試驗中，通過電鏡觀察TiN表面細胞處于良好的狀態，伸展出較多的絲狀偽足，這表明細胞處于活躍的生長遷移狀態。

圖4 成骨誘導14天的茜素紅染色圖片

此外我們進一步進行了材料浸提液的細胞毒性研究，CCK-8檢測結果表明，TiN沒有細胞毒性。這些研究均表明TiN涂層具有良好的生物相容性，這對于生物材料來說非常重要。在成骨活性研究中，長達14天的成骨誘導結果表明TiN能明顯的促進骨髓間充質干細胞的成骨分化。這一結果說明TiN具有良好的成骨活性。

本研究成功通過磁控濺技術在鈦合金表面制備了TiN涂層。通過細胞增殖實驗、細胞黏附實驗、細胞毒性實驗和成骨活性研究對生物相容性和成骨活性進行研究，結果表明TiN具有良好的生物相容性和成骨活性。

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吉林省科技發展計劃國際科技合作項目(20150414006GH)； 吉林省省級經濟結構戰略調整引導資金專項項目(2014G072)

1007-4287(2017)03-0479-03

2016-11-19)

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