杠柳毒苷體外抑制胃癌細胞增殖能力的分子共調控網絡構建研究

王炬瑋，臧文遠,刁 凱,劉海燕

(吉林油田總醫院 1.血液腫瘤科;2.CT科,吉林 松原138000)

杠柳毒苷體外抑制胃癌細胞增殖能力的分子共調控網絡構建研究

王炬瑋1，臧文遠2,刁 凱1,劉海燕1

(吉林油田總醫院 1.血液腫瘤科;2.CT科,吉林 松原138000)

目的 探討構建杠柳毒苷體外抑制胃癌細胞系SGC-7901細胞增殖能力的分子共調控網絡，為解析杠柳毒苷抗腫瘤作用的分子機制提供理論支撐。方法 本研究收集美國GEO公開數據庫中已收錄的所有杠柳毒苷處理胃癌SGC-7901細胞系前后的基因表達譜數據；通過差異表達分析獲得經過杠柳毒苷處理后胃癌SGC-7901細胞系表達水平發生顯著性改變的基因；通過GO基因功能注釋以及KEGG代謝通路富集分析，探究杠柳毒苷作用后表達水平發生顯著性改變基因的功能；最后結合TRED數據庫中收錄的人類轉錄因子信息，構建分子共調控網絡。結果 與胃癌SGC-7901細胞系相比，經杠柳毒苷處理后的SGC-7901，其癌細胞中共有1105個基因發生差異表達，其中552個基因上調表達，553個基因下調表達。基因功能分析顯示，表達上調基因主要參與葡萄糖代謝、鉀離子轉運、鈉離子轉運等生物功能；表達下調基因主要參與同嗜性細胞粘著、氨基酸轉運、小GTP酶介導的信號轉導等生物功能。KEGG代謝通路富集分析結果顯示，差異表達基因主要參與腫瘤相關的諸多代謝通路。最后，基于差異表達基因及TRED數據庫中所收錄的人類轉錄因子信息，對差異表達基因進行分子偶聯，構建了分子共調控網絡。結論 基于分子共表達網絡，對杠柳毒苷的作用分子機制進行了系統性挖掘。

杠柳毒苷；胃癌SGC-7901細胞系；分子共調控網絡；細胞增殖

(ChinJLabDiagn,2017,21:0392)

中藥香加皮(cortex periplocae)是蘿藦科(Asclepiadaceae)杠柳屬(Periploca L.)植物杠柳(PeriplocasepiumBunge)干燥處理后的根皮。味辛、苦，性溫，有毒性，可用于風寒濕痹、腰膝酸軟、心悸氣短、下肢水腫等癥[1]。近年來研究發現，香加皮正丁醇提取物杠柳毒苷(periplocin)對包括食道癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌等在內的多種實體瘤細胞具有較強的腫瘤增殖抑制作用[2-6]。但具體作用的分子機制仍不完善，為進一步探究杠柳毒苷對腫瘤細胞的增殖抑制作用機理，本研究將利用高通量基因芯片技術，挖掘杠柳毒苷體外抑制胃癌細胞增殖能力的分子調控模式，為進一步開發基于杠柳毒苷的抗腫瘤藥物研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數據來源

收集美國國家生物技術信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)維護的GEO數據庫中所有經杠柳毒苷處理的胃癌基因芯片數據，收集數據時間截至2016年5月3日。

1.2 數據庫資源

使用基因本體論數據庫(Gene Ontology，GO)對所分析得到的差異表達基因進行功能注釋；使用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數據庫對差異表達基因進行代謝通路富集分析；使用轉錄作用元件數據庫(Transcriptional Regulatory Element Database，TRED)對差異表達基因進行轉錄因子篩選。

1.3 方法

1.3.1 差異表達基因篩選及注釋 為探究杠柳毒苷對胃癌細胞增殖能力影響的分子機制，使用R語言下載了GEO數據庫中GSE78211數據集的原始數據。使用MAS 5.0算法對數據集中的原始數據進行標準化預處理。使用Limma程序包中所提供的統計分析函數，計算了與胃癌SGC-7901細胞系相比，經杠柳毒苷處理后SGC-7901胃癌細胞中表達水平發生變化的基因。選取差異表達倍數≥5.0(Fold Charge≥5.0)為篩選閾值，篩選獲得差異表達基因。利用R語言，將篩選得到的差異表達基因與GEO數據庫提供的GPL平臺注釋信息進行匹配，對差異表達基因進行信息注釋。

1.3.2 差異表達基因GO功能注釋分析 為探究差異表達基因所參與的生物功能，對篩選得到的差異表達基因進行GO功能注釋分析。提取差異表達基因GPL平臺注釋信息中的“Entrez_Gene_ID”信息，使用R語言GO程序包與GO數據庫信息，對每一個差異表達基因進行功能注釋，探究SGC-7901細胞中每一個經杠柳毒苷作用而發生表達水平改變的基因功能，初步推測杠柳毒苷抗腫瘤作用的分子機制。

1.3.3 差異表達基因KEGG代謝通路富集分析 為進一步探究差異表達基因參與生物代謝的代謝通路，對篩選得到的差異表達基因進行KEGG代謝通路富集分析。提取差異表達基因GPL平臺注釋信息中的“Entrez_Gene_ID”信息，應用R語言KEGG程序包與KEGG數據庫信息，對每一個差異表達基因向已知的代謝通路進行富集映射，探究差異表達基因集中映射的細胞代謝通路，初步推測杠柳毒苷所影響的主要代謝通路。

1.3.4 分子共調控網絡構建 為進一步挖掘杠柳毒苷體外抑制胃癌細胞增殖能力的分子調控模式，探究差異表達基因之間的相互調控作用關系，提取TRED數據庫中所收錄的所有人類轉錄因子數據。通過Pearson相關性分析，提取基因間分子共調控作用關系。使用Cytoscape version 3.3.0軟件對得到的分子共調控作用關系進行可視化展示，構建出最終的分子共調控網絡。

2 結果

本研究共篩選得到差異表達基因1105個，其中552個基因上調表達，553個基因下調表達，表1、2分別展示差異表達最顯著的20個基因。

表1 Top 20上調表達基因信息

表2 Top 20 下調表達基因信息

對552個上調表達基因與553個下調表達基因分別進行GO功能注釋分析。注釋分析結果顯示，上調表達基因主要參與葡萄糖代謝、鉀離子轉運、鈉離子轉運等生物過程(圖1.A)，參與構成鈉離子通道復合體、復制叉、膜筏、生物質膜等細胞組件(圖1.C)，以及參與鈉離子協同轉運載體活性、鉀離子泵活性、DNA結合等分子功能(圖1.E)；下調表達基因主要參與同嗜性細胞粘著、氨基酸轉運、小GTP酶介導的信號轉導等生物過程(圖1.B)，參與聯會絲復合體、分泌顆粒體、細胞鏈接等細胞組件(圖1.D)，參與葡萄糖轉膜轉運復合體活性、小GTP酶調節因子活性等等分子功能(圖1.F)。而對差異表達基因的KEGG代謝通路富集分析結果顯示，差異表達基因主要參與腫瘤相關的諸多代謝通路(圖2)。

基于分子間共調控關系，最終構建了杠柳毒苷作用后SGC-7901胃癌細胞中發生表達改變的分子共調控網絡關系(圖 3)。結果顯示，杠柳毒苷可能通過抑制MYC轉錄因子等經典腫瘤增殖促進因子的表達，間接調控下游眾多基因的表達，最終抑制腫瘤細胞的增殖。

圖1 差異表達基因GO功能注釋分析 A上調表達基因GO功能注釋生物過程(BP)條目；B下調表達基因GO功能注釋生物過程(BP)條目；C上調表達基因GO功能注釋細胞組分 (CC)條目；D下調表達基因GO功能注釋功能注釋細胞組分 (CC)條目；E上調表達基因GO功能注釋分子功能 (MF)條目；F下調表達基因GO功能注釋功能注釋分子功能(MF)條目。

圖2 差異表達基因KEGG代謝通路富集分析 A上調表達基因KEGG富集分析結果；B下調表達基因KEGG富集分析結果。

圖3 杠柳毒苷抑制胃癌SGC-7901增殖的分子共調控網絡 其中紅色圓代表上調表達基因；藍色圓代表下調表達基因；黃色菱形代表轉錄因子。

3 討論

目前已有研究顯示，來源于香加皮的提取物杠柳毒苷在體外對多種實體瘤細胞具有顯著的細胞毒性，能夠顯著抑制腫瘤細胞的增殖。研究證實，杠柳毒苷能夠誘導肺癌A549細胞系細胞、胃癌細胞系BGC-823細胞和乳腺癌MDA-MB-231細胞系細胞的凋亡進程[7-9]。與此同時，杠柳毒苷能夠通過阻滯細胞周期進程，顯著地抑制包括肝癌、結腸癌、乳腺癌等實體瘤細胞系的增殖，而杠柳毒苷的作用效果與其使用量呈正相關[10，11]。

腫瘤是一種復雜的系統性疾病，其發生發展是一系列具有相互作用關系關鍵基因的表達異常所導致的[12，13]，所以藥物對腫瘤細胞的抑制作用同樣是通過復雜的作用方式達到抗腫瘤的效果。然而，傳統針對于單一分子表達異常的“還原論”研究模式，無法從整體系統層面上探究分子間的作用關系，無法具體地勾勒藥物作用的復雜分子機制。同時鑒于杠柳毒苷如何作用于腫瘤細胞，最終導致抗腫瘤效果的分子作用機制尚不明確，本研究利用高通量基因芯片技術，通過生物信息學手段，系統性地預測并構建了一張杠柳毒苷作用于胃癌細胞系SGC-7901的分子共調控網絡。該分子共調控網絡從整體角度分析了經杠柳毒苷處理后SGC-7901細胞系表達發生改變基因間相互作用關系，展示了杠柳毒苷通過調節包括MYC、MYB、SP2在內的關鍵腫瘤增殖相關轉錄因子的表達，間接調控眾多下游基因表達水平的整體基因共調控模式，揭示杠柳毒苷潛在的抗腫瘤作用分子機制。為以杠柳毒苷為基礎的抗腫瘤藥物研發奠定了堅實的理論基礎，同時為抗腫瘤藥物作用機理領域的研究提供了新的研究思路。

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Construction of Gene-Coregulation-Network for Inhibition Activities of Periplocin on gastric cancerexvivo

WANGJu-wei,ZANGWen-yuan,DIAOKai,etal.

(TheGeneralHospitalofJinlinOilField,Songyuan138000,China)

Objective In this study,we constructed a Gene-Coregulation-Network to demonstrate the molecular mechanism of how periplocin inhibits the proliferation of gastric cell line SGC-7901.This study may lay a foundation for underlining the molecular mechanism of the anti-tumor activity of periplocin.Methods By collecting SGC-7901 gene expression profiling data from GEO database,we analyzed the differentially expressed genes.Utilizing GO and KEGG database,we annotated all of the differentially expressed genes.Finally,using transcription factor data provided by TRED database andpearsoncorrelation analysis,we constructed a gene coregulation network.Results Compared with normal SGC-7901 cell lines,1105 genes were differentially expressed in the SGC-7901 cells treated with periplocin,among which 552 genes were up regulated and 553 genes were down regulated.GO annotation results showed that up regulated genes mainly took part in biological functions including glucose metabolism,potassium ion transport and sodium ion transport,and down regulated genes mainly took park in biological functions including hemophilic cell adhesion,amino acid transport,small GTPase mediated signal transduction.KEGG pathway enrichment analysis results showed that,the differentially expressed genes mainly join many cancer-related metabolism pathways.Finally,based on the transcription factor data andpearsoncorrelation analysis,we constructed a gene co-regulation network.Conclusion Based on molecular co-regulation analysis,we systemically mining the molecular mechanism of periplocin.

Periplocin;Gastric cancer SGC-7901 cell line;Gene-coregulation-network;Cell proliferation

1007-4287(2017)03-0392-04

R735.2

A

王炬瑋(1980-)，女，吉林省松原市，碩士，主治醫師，研究方向：腫瘤的診斷與治療。

2016-09-11)