苦豆草生物堿的酶法提取工藝優(yōu)選

李軍 郝彩琴 冷曉紅

【摘要】目的：優(yōu)選苦豆草的酶法提取工藝，提高苦豆草生物堿的提取率。方法：以苦豆草生物堿為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化酶質(zhì)量濃度、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間等工藝參數(shù)。結(jié)果：最佳提取工藝條件為：酶解時(shí)間4h，緩沖液pH=6，酶用量為1mg/g，酶解溫度50℃，酶法提取的提取率比傳統(tǒng)提取法提高了37%。結(jié)論：該工藝簡單、合理，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

【關(guān)鍵詞】苦豆草；生物堿；酶法提取

【中圖分類號(hào)】R284【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）06-0020-03

苦豆草系豆科槐屬苦豆子（Sophora alopecuroides L）的干燥地上部分[1]。苦豆草全株味極苦、性寒、有毒，具有清熱解毒、抗菌消炎的作用，民間用其根治療喉痛、咳嗽、痢疾及濕疹等[2] 。其主要化學(xué)成分為生物堿和黃酮，且生物堿已制成苦參素、婦炎栓、克瀉靈等藥物[3] 。目前，苦豆草中總生物堿的提取多為超聲、微波和回流提取方法[4]，其不易放大到工業(yè)生產(chǎn)、提取率偏低、提取時(shí)間長，而近年來生物酶被用于輔助提取中藥材有效成分。選用恰當(dāng)?shù)拿福梢詼睾偷貙⒅兴幉牡募?xì)胞壁破壞，達(dá)到最高提取收率[5]。酶法提取具有節(jié)約能源和時(shí)間、降低生產(chǎn)成本，產(chǎn)物穩(wěn)定、純度和活性高的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)擬在酸提工藝前加一步酶解過程，使纖維素酶破壞細(xì)胞壁并將纖維素軟化，促進(jìn)有效成分溶出，從而提高苦豆草總生物堿的收率。

1儀器與材料

11儀器往復(fù)式切藥機(jī)（山東青州精誠制藥設(shè)備有限公司）；TU-1810紫外分光光度計(jì)（北京普析通用分析儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫干燥箱（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；AE-240電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；DKB-8A 電熱恒溫水槽（上海精宏儀器設(shè)備有限公司）；130-A 型高速粉碎機(jī)（長沙市中南制藥機(jī)械廠）。

12材料苦豆草（采于鹽池縣花馬池鎮(zhèn)德勝墩自然村等地）經(jīng)鑒定為豆科槐屬植物苦豆子（Sophora alopecuroides L）地上部分，粉碎備用；纖維素酶（150000u/g）購于寧夏和氏璧生物有限公司，槐定堿對照品購于中國食品藥品檢定研究院；所用試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

21苦豆草提取物含量測定苦豆草總生物堿含20多種單體，其中以槐定堿的含量最高，參考相關(guān)文獻(xiàn)[4]采用溴麝香草酚藍(lán)比色法以槐定堿為指標(biāo)成分測定苦豆草總生物堿含量（λ=410nm）。具體方法如下。

211標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱定槐定堿對照品5mg，置5mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得槐定堿對照液。取上述溶液0、20、40、60、80、100、120、140μL，分別置于50mL的磨口錐形瓶中，揮盡乙醇，加溴麝香草酚藍(lán)pH=76緩沖液12mL、氯仿12mL，密塞劇烈振搖2min，靜置2h后分出氯仿層，以第一個(gè)為空白，于410nm處測定提取液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，氯仿層濃度為橫坐標(biāo)得回歸方程（A=00133C-00134，R=09996，線性范圍為1667 ～ 11667μg/mL）。

212樣品含量測定分別吸取傳統(tǒng)酸提法或者酶提取法的濾液1mL，稀釋至100mL，吸取02mL至錐形瓶中，加入溴麝香草酚藍(lán)pH=76緩沖液12mL，氯仿12mL，密塞振搖2min，加入50mL錐形瓶中，靜置2h，分取氯仿層，以對應(yīng)的提取溶劑1mL，溴麝香草酚藍(lán)pH=76緩沖液12mL和氯仿12mL同比操作為空白，于410nm處測定提取液的吸光度A，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算苦豆草總生物堿的含量[4]。

22苦豆草總生物堿的提取

221傳統(tǒng)酸提法取苦豆草干燥藥材細(xì)粉約10g，精密稱定，加入04%鹽酸300mL，回流提取4h，濾過，收集濾液按212方法進(jìn)行含量測定。

222酶提取法取苦豆草干燥藥材細(xì)粉約10g，精密稱定，加入磷酸-磷酸鈉緩沖溶液（pH=5），再加入纖維素酶（1∶[KG-*3/5]500），恒溫水浴反應(yīng)4h后，加入鹽酸至溶液成04%鹽酸，按“221”項(xiàng)下方法提取后過濾，收集濾液按“212”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測定。

23纖維素酶輔助提取工藝條件優(yōu)化

231酶質(zhì)量濃度的影響在50℃、pH值為50、酶解4h，酶用量分別為2、1、04、02、01 mg/g條件下按“222”項(xiàng)下酶提法進(jìn)行提取苦豆草，過濾后收集濾液測含量考察酶用量對苦豆草總生物堿提取率的影響。結(jié)果顯示，隨著酶用量的增加生物堿提取率逐漸增加，酶用量為2mg/g時(shí)提取率最高。由于酶用量1mg/g和2mg/g對生物堿提取率的影響不大，考慮成本問題，故選擇1mg/g。見圖1。

232pH值的影響纖維素酶的質(zhì)量濃度為1mg/g，在50℃、pH值在4、45、5、55、6 條件下酶解4h，酶解后04%鹽酸提取考察pH值對提取率的影響。結(jié)果顯示，纖維素酶在pH=55時(shí)提取效果最好。見圖2。

[JP2]233酶解溫度的影響在纖維素酶的質(zhì)量濃度為1mg/g，pH 值55，35、40、45、50、55℃不同溫度下酶解4h，酶解后04%鹽酸回流提取。當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)，苦豆草生物堿提取率最高。見圖3。[JP]

234酶解時(shí)間的影響使纖維素酶的質(zhì)量濃度為1mg/g，在50℃，pH值為55時(shí)，酶解1、2、3、4、5h，然后04%鹽酸加熱回流提取。隨著酶解時(shí)間的延長，提取率不斷增加，酶解5h時(shí)提取率最高。見圖4。

24正交設(shè)計(jì)及優(yōu)化以酶解時(shí)間（A）、pH值（B）、酶用量（C）和酶解溫度（D）為因素，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定每個(gè)因素的3個(gè)水平，按表L9（34）設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，以2次平行操作所得苦豆草生物堿的平均得率為評價(jià)指標(biāo)。因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，四個(gè)因素對提取率的影響主次順序?yàn)锳 > B > C >D。并得出最佳的提取工藝條件是：A2B3C2D3，即酶解時(shí)間4h，緩沖液pH=6，酶用量為1mg/g，酶解溫度50℃。

3討論

中藥中根莖皮類藥材的細(xì)胞壁中纖維素含量較高，植物的有效成分一般都包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，纖維素酶可破壞纖維素的結(jié)構(gòu)，從而使有效成分從植物細(xì)胞壁中溶出，提高了有效成分的提取效率[6]。本工藝首先運(yùn)用纖維素酶將藥材細(xì)胞壁中的纖維素降解，降低了生物堿從植物細(xì)胞中溶出的傳質(zhì)阻力；其次，提取溶劑中加入鹽酸除滅活酶外還與生物堿成鹽，進(jìn)一步促進(jìn)了生物堿的溶出[7]。通過正交試驗(yàn)找出了酶輔助提取工藝的最優(yōu)條件，其苦豆草生物堿的提取率為224%，未經(jīng)酶解的酸回流提取為163%，酶法提取率提高了37%，可見酶解處理有助于苦豆草生物堿的溶出。因此，纖維素酶可以降解并破壞植物顯微組織，促進(jìn)生物堿的溶出，從而提高了收率[8]。同時(shí)酶法提取只是在原有工藝基礎(chǔ)上增加酶解過程，而不必對原有工藝進(jìn)行大的改變，而且操作簡便易行，不需另外添加生產(chǎn)設(shè)備，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2017-01-10編輯：穆麗華）