15N同位素稀釋技術和示蹤技術在森林土壤N素研究中的應用

文哲

摘 要 森林土壤N素形態、N庫動態及其運移轉化特征備受關注。采用穩定性15N同位素稀釋技術和示蹤技術測定森林土壤總N轉化速率和15N回收率，可以揭示森林土壤N素特別是無機N的運移轉化規律和持留機制。由此可見，穩定性15N同位素技術在森林土壤N循環研究中的作用舉足輕重?；诖耍榻B15N同位素稀釋技術測定土壤總N轉化速率的基本原理和15N同位素示蹤技術研究土壤N素運移規律的基本思路，并簡要列舉了穩定性15N同位素技術和示蹤技術在森林土壤N素轉化、運移和持留機制研究中的應用實例，同時指出此法的不足和應用前景。

關鍵詞：總N轉化速率；持留機制；15N同位素稀釋技術；15N同位素示蹤技術；同位素分餾

中圖分類號：S153.6 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.30.059

1 15N同位素稀釋和示蹤技術基本原理

15N同位素稀釋技術是量化土壤總N轉化速率的有效方法，是依賴于對某一形態產物的15N標記及其稀釋和富集動態監測[1]，15N同位素示蹤技術則主要依賴于對一形態底物的15N的標記及其稀釋和富集動態監測。由此可見，利用15N同位素稀釋和示蹤原理，不僅可以量化土壤N轉化速率，還可揭示N素生產和消耗途徑。

2 15N同位素稀釋和示蹤技術方法

目前，利用15N同位素稀釋和示蹤技術研究N素總轉化速率的分析方法有算術分析法和數值分析法兩種。基于Kirkham和Bartholomew提出15N同位素稀釋法模型，Blackburn提出了低豐度的15N標記方法，公式如下：

m=（M0-M1）/t×log（H0M1/H1M0）/log（M0/M1），c≠m

c=（M0-M1）/t×log（H0/H1）/log（M0/M1），c≠m

m=c=M0/t×log（H0/H1），c=m

式中，M0：培養過程to時刻的N的總含量15N+14N；M1：培養過程t1時刻N的總含量15N+14N；H0：培養過程to時刻15N百分超，即被標記的15N豐度和15N自然豐度之差；H1：培養過程t1時刻15N百分超；t：測定時間間隔即t=t1-to；m：總N產生速率；c：總N消耗速率。

上述方程既可用15NH4+-N或15NO3--N標記[2]。

由于森林土壤N循環過程復雜，需要量化的參數多，而基于算術分析的15N同位素標記方法由于未考慮15N再礦化這一因素，只適合短期測定，且量化的參數少，數值分析法因為克服上述問題越來越受到重視。有關N素總轉化速率量化的數值分析法，程誼 等[3]做了很好的歸納。目前，Müller等基于馬爾柯夫鏈蒙特卡洛隨機采樣方法開發的15N同位素示蹤過程模型，將土壤有機N庫拆分為活性、惰性氮庫，允許采用零級、一級和米門動力學公式對N轉化進行描寫，可對有機N的礦化、NH4+固持到難分解有機N、易分解有機N的礦化、NH4+固持到易分解有機N、總N礦化、總NH4+固持、自養硝化、異養硝化、總硝化、總NO3-固持和硝酸鹽異化為銨（DNRA）等過程進行同步量化，備受關注。

3 森林土壤N轉化、運移關鍵過程的15N同位素研究

森林土壤N素轉化過程，如N礦化、硝化、反硝化和硝酸鹽異化還原為銨（DNRA）和N微生物固持、植物N素吸收均存在不同程度的N同位素分餾效應。通過N同位素分餾效應的研究，可有效揭示植物、微生物N的利用途徑。

利用15N同位素稀釋技術和示蹤技術來分析土壤N素遷移轉化動態，是當前森林生態學一個研究重點。相關研究主要可回答如下問題：第一，森林土壤總N礦化速率和凈N礦化速率比例關系及其關鍵調控因子；第二，森林土壤微生物和植物根系對N素的競爭中誰占優勢；第三，全球大氣N沉降增加背景下，外源性N輸入對不同類型的森林土壤N循環產生的影響。需要說明的是，土壤總N礦化速率和凈N礦化速率比例關系因森林類型、土壤肥力和土層深度等不同而有所差異。如Zhang等[4]則采用15N同位素稀釋法和模型分析來量化土壤N轉化速率，研究發現，與北方溫帶針葉林相比，中國南方亞熱帶森林土壤N礦化速率高和N周轉快。

運用穩定性15N同位素示蹤技術可以揭示森林生態系統植物和土壤微生物的N競爭關系。有關森林植物和土壤微生物對N的競爭的研究主要圍繞兩點展開，一是在N源的競爭上存在無機N源和有機N源之爭；二是在競爭關系上，植物和微生物對N競爭的相對優勢。傳統觀點認為，植物僅能利用土壤有機物經礦化作用形成的無機態N。相應地，植物和微生物對N源的競爭主要圍繞NH4+-N和NO3--N展開。植物和微生物對無機N的競爭的證據來源長期和短期的15N同位素示蹤實驗，土壤無機N庫標記豐度較高豐度的15NH4+-N和15NO3--N，經過短期培養（15 d），測定植物、微生物和土壤無機N庫及其同位素組成。在長期的15N同位素實驗中，采用相同的示蹤技術，不同的是測定的時間為培養后的數周或數月?；?5N同位素示蹤實驗研究的結果，目前較為流行的觀點是，短期時微生物在無機N的競爭上占有優勢，且微生物偏向于利用NH4+-N，長期而言植物是最終的贏家。近年來，借助15N同位素示蹤技術，越來越多的證據顯示植物根系，尤其是和菌根真菌有聯系的植物根系，可以直接吸收有機態N。植物根系對有機N的吸收能減少植物對微生物礦化N的依賴，潛在緩解植物和微生物對N素的競爭。盡管如此，上述研究仍無定論，尤其是根際土壤微生物-植物的N素營養競爭關系知之甚少。

在全球大氣N沉降增加的背景下，當前生態學界普遍關注的一個的問題是外源性N輸入對森林生態系統C循環和養分循環有何影響。當外源性N輸入超過生態系統生物生理需求和非生物持留能力時，森林土壤出現“N飽和”現象，伴隨著NO3--N淋溶加劇、凈硝化作用增加、N礦化先增加后降低、氣態N損失和土壤酸化等一系列土壤過程非線性變化響應。簡而言之，在外源性N輸入的情形下，礦物N相對豐富的熱帶、亞熱帶和溫帶森林土壤N循環易由封閉狀態向開放狀態（如反硝化和淋溶）的轉變。而有關N沉降對森林土壤N素循環的影響，多數研究結果集中在凈N礦化速率層面。Corre等采用15N同位素稀釋法研究則發現，德國云杉林土壤總N礦化、總硝化在中等富N狀態下達到最大，在高度富N狀態下均有所下降。

4 森林土壤N素持留機制的15N同位素研究

一般來說，礦物N相對豐富的生態系統，如熱帶、亞熱帶和溫帶森林土壤N礦化和硝化速率快，加大了N素流失特別是NO3--N淋溶風險的同時也形成了有效的N素持留機制：如調控植物和微生物對N素的吸收、硝酸鹽異化還原為銨（DNRA）、NO3--N非生物性吸持為土壤有機質（SOM）和土壤有機N（SON）再礦化、低土壤pH值抑制氨氣（NH3）揮發等。Stark等采用15N同位素稀釋技術研究墨西哥和俄勒岡州未受干擾的針葉林土壤NO3--N的動態時發現，盡管土壤總硝化速率相當高，而微生物能快速同化所產生的NO3--N。與Stark等結果一致，Zhu等[5]

采用15N同位素示蹤技術對中國亞熱帶酸性森林土壤研究發現，土壤產生的NO3--N中有17.2%～74.9%被微生物固持。對此，Huygens等[6，7]利用15N同位素稀釋技術和15N示蹤技術研究智利南部常綠假山毛櫸雨林火山土壤的N循環過程，發現異養硝化及其耦合的DNRA過程、NO3--N轉化為不易淋溶損失的有機態N、溶解性有機N（DON）轉化和溶解性無機N（DIN）過程的解耦三個過程對于原始溫帶雨林生物可利用性N持留作用重大。他們的研究顯示，添加15N一年后，15NH4+-N和15NO3--N的回收率分別為84%、69%，表明大量的NH4+-N和NO3--N被該森林土壤截留。異養硝化作用對總NO3--N生產的貢獻達96%，總無機N的貢獻約為10%。大約26%通過異養硝化產生的NO3--N經DNRA過程迅速轉化為NH4+-N，大約69%通過異養硝化產生的NO3--N固持到不同的有機N庫。最近，Zhang等[4]的15N同位素示蹤研究顯示：中國南方的酸性森林0～20 cm土壤NH4+-N的產生速率為（3.04±0.90）mg/

（kg·d），NH4+-N的固持速率為（1.80±1.13）mg/（kg·d），自養硝化速率為（0.14±0.17）mg/（kg·d），異養硝化速率為（0.70±0.46）mg/（kg·d），NO3--N吸持為SOM速率為（0.65±0.41）mg/（kg·d）和DNRA速率為（0.04±0.03）mg/（kg·d）。中國北方森林0～20 cm土壤NH4+-N的產生速率為（1.80±0.50）mg/（kg·d），NH4+-N的固持速率為（0.59±0.96）mg/（kg·d），自養硝化速率為（1.07±1.57）mg/（kg·d），異養硝化速率為（0.22±0.31）mg/（kg·d），NO3--N吸持為SOM速率為（0.04±0.11）mg/（kg·d）和DNRA速率為（0.05±0.04）mg/（kg·d）?；谏鲜鲅芯拷Y果，Zhang等[4]闡明中國南方酸性森林土壤無機N的保留機制為低的異養硝化速率、低的NH3揮發速率、較高速率的NO3--N固持為有機N抵消了徑流、淋溶和反硝化的影響。

5 研究不足與展望

盡管15N同位素稀釋技術和示蹤技術能準確地測定森林土壤N素總轉化速率，但測定結果受諸多條件限制，存在較大的不確定性。如果不能合理解釋利用15N標記測定的結果，易得出誤導性的結論。這就要求在實驗技術上，確保15N均勻標記于土壤。目前，多孔細針注射法可以降低操作上的誤差。另一個問題是，室內溶液注射易改變土壤水分，野外15N的添加可能由于NH3的揮發或NO3--N淋溶造成標記的15N損失，且外源性添加的15N是否產生激發效應（如硝化作用強的森林土壤），有待確定。再者，由于土壤粘土礦物的吸附，起始標記的部分15N如15NH4+-N被吸附，測定N素總轉化速率需要待吸附平衡后確定一個合理的起始時間。

當前，有關森林土壤N素總轉化速率和土壤溫室氣體如N2O通量的15N同位素研究十分豐富。然而，極少有研究能將森林土壤含N溫室氣體通量和土壤N素總轉化速率結合分析，同時量化硝化、反硝化過程對N2O排放的相對貢獻。在全球大氣N沉降增加的背景下，外源性N持續輸入在多大程度會影響森林土壤N循環過程、改變植物和土壤微生物間的N素競爭關系；在森林土壤“N飽和”過程中，會形成何種N素持留機制；N沉降增加導致的森林土壤N2O凈排放通量發生改變的N素調控機制，和硝化作用和反硝化作用的關系，這些將是今后研究的重點和難點，離不開穩定性15N同位素稀釋技術和示蹤技術的支撐。

參考文獻

[1]Killham， K.Soil ecology[M].Cambridge University Press，1994.

[2]AK Das， L Boral， RS Tripathi， et al. Nitrogen mineralization and microbial biomass-N in a subtropical humid forest of Meghalaya， India[J]. Soil Biology & Biochemistry， 1997， 29（9-10）：1609-1612.

[3]程誼，蔡祖聰，張金波.15N同位素稀釋法測定土壤氮素總轉化速率研究進展[J].土壤，2009，41（2）：165-171.

[4] Zhang J， Cai Z， Zhu T， et al.Mechanisms for the retention of inorganic N in acidic forest soils of southern China[J]. Scientific Reports，2012，3（6145）：2342.

[5]Zhu T， Meng T， Zhang J， et al. Nitrogen mineralization， immobilization turnover， heterotrophic nitrification， and microbial groups in acid forest soils of subtropical China[J]. Biology and Fertility of Soils， 2013， 49（3）：323-331.

[6]Huygens D， Rutting T， Boeckx P， et al. Soil nitrogen conservation mechanisms in a pristine south Chilean Nothofagus forest ecosystem[J]. Soil Biology & Biochemistry， 2007，39（10）：2448-2458.

[7]Huygens D， Boeckx P， Templer P， et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils[J]. Nature Geoscience， 2008，1（8）： 543-548.

（責任編輯：趙中正）