貯藏時間和貯藏方式對八角茴香油質量及抑菌活性的影響

李萍，舒展，申曉霞，黃治強

(天津農學院 基礎科學學院，天津，300384)

·貯運與保鮮·

貯藏時間和貯藏方式對八角茴香油質量及抑菌活性的影響

李萍*，舒展，申曉霞，黃治強

(天津農學院 基礎科學學院，天津，300384)

為探討八角茴香油的最佳貯藏方式，采用稱重法和瓊脂-孔洞擴散法分別研究了八角茴香油在3種不同貯藏方式下質量和抑菌活性隨時間的變化規律。結果表明：水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油共有12種組分，主要成分類型是苯基丙烯基類化合物，其中反式茴香腦含量為94.897%。隨著時間的延長，八角茴香油質量和抑菌活性均有一定程度下降。光照在短時間內對八角茴香油質量損失影響很小，溫度對質量損失有較大影響。在107 d監測期內，八角茴香油對所有供試菌種的抑制活性始終是室溫閉口自然光貯藏方式下最好，室溫閉口自然光貯藏是八角茴香油的安全貯藏方式。隨著濃度的增加，八角茴香油對供試菌種抑制作用加強。八角茴香油對供試微生物的抑制效果隨時間延長雖然下降，但107 d后室溫閉口自然光貯藏的濃度為333.3 mg/mL的八角茴香油對所有供試細菌和酵母菌抑制率仍然在50%以上，保持了對細菌和酵母菌良好的抑菌活性。在實驗濃度內，八角茴香油對大腸桿菌抑制效果始終高于其他菌種，但對兩種霉菌的抑制效果難以較長時間保持。

八角茴香油；貯藏時間；貯藏方式；質量；抑菌活性

食物易受病原微生物侵擾，引起食源性疾病。化學保鮮劑由于價格低廉、有效，目前仍然是果蔬貯藏保鮮的主要措施。但是，多數化學保鮮劑殘留較高，可能對人類健康造成危害[1-2]。研究發現，多種植物精油具有顯著的抑菌效果，是一類安全有效的天然植物源抗菌劑，在食品保鮮領域具有廣闊的應用前景[3-5]。其中，八角茴香油是從八角果實、枝、葉等部位提取得到的無色至淺黃色透明油狀液體，是八角茴香有效成分之一。關于八角茴香油的組成、抗病毒、抗氧化、殺蚊蟲、抗菌等活性已有大量報道[6-10]，八角茴香油甚至還可以摻入殼聚糖中制成可食用抗菌膜，延長食品保質期[11]。然而，八角茴香油易揮發、穩定性差，在貯藏過程中易受空氣、光照、溫度等影響導致質量和生理活性的變化，甚至產生不愉快氣味[12]。關于八角茴香油在不同貯藏方式下質量和抑菌活性隨時間的變化情況未見文獻報道，對八角茴香油的最佳貯藏方式和保質期也未見建議和明確界定。

八角茴香油的提取方法很多，如水蒸氣蒸餾法、超臨界萃取法和有機溶劑提取法等[13-14]。其中，水蒸氣蒸餾法是我國藥典推薦的植物精油提取方法，在工業上也得到廣泛應用。有文獻報道稱，水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油，其主要成分反式茴香腦含量及抑菌活性比有機溶劑提取法高[15]。因此，本文以水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油為試材，研究3種不同貯藏方式下八角茴香油質量和抑菌活性隨時間的變化規律，探討影響八角茴香油貯藏穩定性的一些因素(如光照、溫度等)，以期尋找八角茴香油的最佳貯藏方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：大紅八角，產地廣西，9～10月采收，購于農貿市場。大紅八角整果(帶種子)室溫下陰干兩周，粉碎，過20目篩，取篩下粉末備用。

供試微生物：3種細菌(大腸桿菌、產氣腸桿菌、枯草芽孢桿菌)；2種酵母菌(啤酒酵母、釀酒酵母)；2種霉菌(青霉、黑曲霉)，由天津農學院農學與資源環境學院微生物實驗室提供，4℃斜面保存，用前活化。培養基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(細菌用)；酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基(酵母菌用)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(霉菌用)。

試劑：NaCl、石油醚(30～60 ℃)，無水Na2SO4、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)均為分析純，正己烷，色譜純。

1.2 儀器與設備

粉碎機，北京燕山正德機械設備有限公司；移液器，德國Eppendorf公司；DX-35BI型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司；Thermo Scientific MSC-Advantage Ⅱ級生物安全柜，德國Thermo Fisher Scientific公司； LRH-250-S恒溫恒濕培養箱，廣東省醫療器械廠； 7890A/5975C型氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 水蒸氣蒸餾法提取八角茴香油

稱取30 g八角茴香果實粉末(準至0.000 1 g)置于圓底燒瓶中，加入600 mL蒸餾水，浸泡24 h。水蒸氣蒸餾至餾出液不再混濁為止，收集餾出液，冷至室溫，鹽析，轉入分液漏斗，石油醚萃取2次(每次20 mL)，合并上層石油醚層，無水硫酸鈉干燥，過濾，水浴回收石油醚，殘留物即為八角茴香油，稱重，按公式(1)計算提取率[16]。

(1)

1.3.2 氣相色譜-質譜(GC-MS)定性分析及定量測定

色譜條件：根據文獻9的GC-MS測試條件并做適當修改，HP-5MS色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；載氣(He)流速1.0mL/min；進樣口溫度220 ℃，自動進樣，進樣量0.5μL，分流比20∶1；升溫程序：初始60 ℃，保持1min，5 ℃/min升至160 ℃，保持4min，5 ℃/min升至210 ℃，保持5min，總運行時間40min。

質譜條件：電子轟擊離子源：電子能量70eV，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，采集模式：全掃描，質量掃描范圍：30～550amu。組分的定性鑒定是采用NIST2008標準譜庫進行檢索并與相關文獻比較，用峰面積歸一化法計算各成分相對百分含量。

采用選擇離子監測模式[17-18]定量測定107d后不同貯藏方式下八角茴香油中主要成分反式茴香腦的殘留情況，特征離子為m/z=105.0、117.0、133.0、148.0，定量離子為m/z=148.0。標準曲線的制作：反式茴香腦用正己烷稀釋成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8g/mL，按選定的色譜、質譜條件，以反式茴香腦濃度為橫坐標，響應值為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程：y=1.480E+06c-84 535，y為響應值，c為反式茴香腦濃度，單位為g/mL，R2=0.998 1(n=5)。

1.3.3 貯藏時間和貯藏方式對八角茴香油質量的影響

八角茴香油分別置于室溫敞口自然光、室溫閉口自然光、室溫閉口避光和冰箱冷藏閉口避光4種方式下貯藏107d，監測時間為2015年6～9月，間隔一定時間取樣并稱量八角茴香油的質量，每種處理重復3次，取平均值作為測定結果，按公式(2)計算其質量損失率。

(2)

1.3.4 貯藏時間和貯藏方式對八角茴香油抑菌活性的影響

分別將八角茴香油置于室溫閉口自然光、室溫閉口避光和冰箱冷藏閉口避光3種方式下貯藏107 d，間隔一定時間取樣并采用瓊脂-孔洞擴散法測定八角茴香油的抑菌活性。

供試樣品溶液配制：八角茴香油原液濃度為1 000.0 mg/mL，用DMF作溶劑，采用3倍連續稀釋法配制一系列不同濃度的八角茴香油供試樣品溶液。

菌懸液制備：活化后的菌種接入液體培養基(不加瓊脂)，搖床培養。細菌用平板稀釋法計算菌落數[19]，酵母用血球計數法計算菌落數[19]，用無菌生理鹽水調節細菌和酵母菌懸液濃度均為107CFU/mL。霉菌培養后用適量無菌生理鹽水沖洗并收集孢子，充分振蕩，制成孢子數為107個/mL的菌液。

瓊脂-孔洞擴散法測定抑菌活性操作步驟：滅菌培養基冷至50 ℃，加入5 mL菌懸液，混勻，倒入直徑9 cm培養皿中，每皿20 mL，靜置40 min。在固化后的培養基上用無菌打孔器均勻打孔(直徑7 mm)，記號。每孔加入40 μL不同濃度的八角茴香油供試樣品溶液，DMF作空白對照。細菌37 ℃培養24 h，酵母菌28 ℃培養48 h，霉菌25 ℃培養72 h。測量并記錄抑菌圈直徑(mm)，每個濃度重復3次，取平均值作為測定結果，按公式(3)計算八角茴香油對供試菌種抑制率[20-21]。

(3)

2 結果與分析

2.1 水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油化學組成分析

水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油為淺黃色透明油狀液體，具有八角茴香氣味，提取率為8.5%。采用GC-MS對八角茴香油的化學組成進行分析，圖1顯示了總離子流色譜圖，表1列出了組分鑒定結果。

表1 八角茴香油化學組成

注：組分是按照它們從HP-5MS柱子上的洗脫順序列出。

圖1 水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the star anise oil extracted by hydro-distillation注：圖1中峰號的數字與表1的物質序號對應一致。

可以看出，水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油中共鑒定出12種組分，化學成分類型包括：苯基丙烯基類(97.244%)、醛類(1.055%)、苯基烯丙基類(0.706%)、單萜類(0.374%)、單萜醇類(0.349%)、甲苯(0.137%)和單環倍半萜類(0.135%)，最主要成分反式茴香腦含量為94.897%，文中的水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油中最主要成分反式茴香腦及其含量與HUANG等[22](89.5%)和RITTER等[23](98.1%)的研究結果一致，但精油其他組分和含量略有區別，這可能與八角茴香果實的來源、生長環境、采收時間和提取方法有關。

2.2 貯藏時間和貯藏方式對八角茴香油質量的影響

4種貯藏方式下八角茴香油質量損失率隨時間的變化見圖2。

可見，隨著時間的延長，不同貯藏方式的八角茴香油質量損失均有所增加。其中，室溫敞口自然光貯藏的八角茴香油質量損失最嚴重，第1天就達到41.75%，此后損失趨于平緩，107 d后損失率為64.41%，說明八角茴香油具有很強的揮發性，常溫下即可揮發。精油中較低分子質量的萜類(尤其是單萜和倍半萜)和醇類在貯存前半期非常容易揮發[24]，反式茴香腦長時間貯存，含量也會有所下降，這些都會導致八角茴香油在貯藏過程中質量的損失。此外，還可以看出，室溫閉口自然光與室溫閉口避光貯藏的八角茴香油質量損失率非常接近，尤其是貯藏27 d后，曲線幾乎重合，說明光照條件在短時間內對八角茴香油的質量損失影響很小。冰箱冷藏閉口避光貯藏的八角茴香油質量損失最小，107 d后損失率為22.48%，比室溫閉口避光貯藏的八角茴香油的損失還少16.42%，說明溫度對八角茴香油質量損失有較大影響，低溫貯藏有利于減弱八角茴香油的揮發損失。

2.3 貯藏時間和貯藏方式對八角茴香油抑菌活性的影響

2.3.1 不同貯藏方式下八角茴香油對同一菌種抑制活性的變化

圖3顯示了3種貯藏方式下八角茴香油對同一菌種抑制活性隨時間的變化情況。

(a)大腸桿菌；(b)產氣腸桿菌；(c)枯草芽孢桿菌；(d)啤酒酵母；(e)釀酒酵母；(f)青霉；(g)黑曲霉圖3 不同貯藏方式下八角茴香油對同一菌種抑制活性的變化Fig.3 Changes of antimicrobial activities of star anise oil under different storage ways against the same strain(注：八角茴香油質量濃度為333.3 mg/mL)

可見，隨著時間的延長，不同貯藏方式的八角茴香油對同一菌種抑制率均呈下降趨勢，前7 d內變化最快，此后趨于平緩。107 d內，八角茴香油對大腸桿菌和產氣腸桿菌抑制活性始終是室溫閉口自然光>冰箱冷藏閉口避光>室溫閉口避光，而對枯草芽孢桿菌抑制活性始終是室溫閉口自然光>室溫閉口避光>冰箱冷藏閉口避光；對供試2種酵母菌和2種霉菌抑制活性始終是室溫閉口自然光>室溫閉口避光>冰箱冷藏閉口避光。可以看出，在107 d貯藏監測期內，八角茴香油對所有供試菌種抑制活性始終都是室溫閉口自然光貯藏方式下最好。

圖4是瓊脂-孔洞擴散法測定八角茴香油抑菌活性的培養皿照片，可見，抑菌圈形狀完整，清晰，此方法測定結果準確可靠。

八角茴香油的抑菌活性與其主要成分反式茴香腦有關，HUANG等[22]研究了八角茴香油及其主要成分反式茴香腦對11種霉菌的抑制作用，發現反式茴香腦是八角茴香油具有抗真菌活性的主要原因；KARAPINAR[25]等證實了茴香腦對3種食源性致病菌的抑制作用；QIU等[26]報道了八角茴香油對金黃色葡萄球菌的抑制作用主要源于高含量的反式茴香腦。GC-MS檢測到107 d后，貯藏在室溫閉口自然光下八角茴香油中主要成分反式茴香腦的殘留濃度為0.62 g/mL，是3種貯藏方式中最高的(表2)。冰箱冷藏閉口避光貯藏的八角茴香油中反式茴香腦濃度降低最多，殘留濃度僅為0.38 g/mL，雖然冰箱冷藏閉口避光貯藏的八角茴香油質量損失最小(107 d后損失率為22.48%)，但在此條件下貯藏的八角茴香油對供試酵母菌和霉菌的抑制活性難以較長時間保持。相反，室溫閉口自然光貯藏有利于八角茴香油對食源性致病菌及酵母菌、霉菌等果蔬腐敗性真菌抑制活性的維持，延長果蔬保質期。結合抑菌活性的變化規律及GC-MS定量分析結果可知，室溫閉口自然光貯藏有利于八角茴香油對供試菌種抑制活性的較長時間保持，是八角茴香油的安全貯藏方式。

(a)大腸桿菌；(b)產氣腸桿菌；(c)枯草芽孢桿菌；(d)啤酒酵母；(e)釀酒酵母；(f)青霉；(g)黑曲霉圖4 瓊脂-孔洞擴散法測定八角茴香油抑菌活性的培養皿照片Fig.4 Petri dish photos of antibacterial activity of star anise oil determined by agar-hole diffusion assay(注：八角油的濃度分別為：1孔：1 000.0 mg/mL；2孔：333.3 mg/mL；3孔：111.1 mg/mL；4孔：37.0 mg/mL；5孔：12.3 mg/mL)

八角茴香油響應值殘留濃度/(g·mL-1)室溫閉口自然光8330650.62室溫閉口避光7146650.54冰箱冷藏閉口避光4706990.38

注：八角茴香油中反式茴香腦的初始濃度為0.95 g/mL。

2.3.2 濃度對八角茴香油抑菌活性的影響

室溫閉口自然光貯藏的不同濃度八角茴香油對供試菌種抑制活性隨時間的變化情況見圖5。

八角茴香油的濃度分別為(a)333.3 mg/mL；(b)111.1 mg/mL；(c)37.0 mg/mL圖5 室溫閉口自然光貯藏的八角茴香油對供試菌種抑制活性的變化Fig.5 Changes of inhibitory effects of the star anise oil sealed stored under natural light at room temperature against tested strains

可見，隨著濃度的增加，八角茴香油對供試菌種抑制作用加強。供試微生物中既有革蘭氏陰性菌又有革蘭氏陽性菌、酵母菌和霉菌，說明八角茴香油具有廣譜抗菌性。貯藏107 d內，不同濃度八角茴香油對大腸桿菌的抑制效果始終高于其他菌種，說明其可以減弱大腸桿菌對果蔬的侵蝕，減少食源性疾病。室溫閉口自然光下貯藏107 d后，濃度為333.3、111.1、37.0 mg/mL的八角茴香油對大腸桿菌抑制效果分別下降了15.75%、19.95%、31.47%，對黑曲霉抑制效果分別下降了34.62%、24.18%、16.99%。此外，不同濃度八角茴香油對供試微生物抑制效果隨時間的延長雖然下降，但室溫閉口自然光下貯藏107 d后，濃度為333.3 mg/mL的八角茴香油對所有供試細菌和酵母菌抑制率仍然在50%以上，保持了對細菌和酵母菌良好的抑菌活性。在實驗濃度范圍內，八角茴香油對兩種霉菌的抑制效果難以較長時間保持。

3 結論

本文研究了水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油在3種不同貯藏方式下質量及抑菌活性隨時間的變化規律，結論如下：水蒸氣蒸餾法提取的八角茴香油共有12種組分，主要成分類型是苯基丙烯基類化合物，反式茴香腦含量為94.897%。隨著時間的延長，八角茴香油質量和抑菌活性均有一定程度下降。光照在短時間內對八角茴香油質量損失影響很小，溫度對質量損失有較大影響。在107 d監測期內，八角茴香油對所有供試菌種抑制活性始終是室溫閉口自然光貯藏方式下最好，室溫閉口自然光貯藏是八角茴香油的安全貯藏方式。隨著濃度的增加，八角茴香油對供試菌種抑制作用加強。八角茴香油對供試微生物抑制效果隨時間的延長雖然下降，但107 d后室溫閉口自然光貯藏的濃度為333.3 mg/mL的八角茴香油對所有供試細菌和酵母菌抑制率仍然在50%以上，保持了對細菌和酵母菌良好的抑菌活性。在實驗濃度內，八角茴香油對大腸桿菌抑制效果始終高于其他菌種，但對2種霉菌的抑制效果難以較長時間保持。

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Effects of storage time and methods on weight loss and antimicrobial activity of star anise oil

LI Ping*, SHU Zhan, SHEN Xiao-xia, HUANG Zhi-qiang

(College of Basic Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

The changes of weight and antimicrobial activities of star anise oil stored under three different methods were studied. Weighting method and agar-hole diffusion assay were used to investigate the best storage way for star anise oil. Chemical composition of hydro-distillation extracted star anise oil was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). Twelve compounds were identified and main component was phenyl propenyl，andtrans-anethole content was 94.897%. The weight loss and antimicrobial activity of star anise oil all showed a certain degree of declination with time increasing under different storage conditions. Light had little effect on weight loss，while temperature had great impact. Star anise oil sealed stored under natural light at room temperature showed the best bacterial inhibitory activity during 107 day experiment. This indicated that sealed stored under natural light at room temperature was a safe storage. The inhibitory effect on the tested strains increased with oil concentration increasing. Although，the inhibitory effect of star anise oil against tested strains reducing with time increasing， sealed packing under natural light at room temperature with a concentration of 333.3 mg/mL still remained more than 50% of inhibition activity after 107 days. In addition，star anise oil showed higher inhibitory effect onEscherichiacolithan other strains during the storage, but hard to maintain the inhibitory effect on two molds.

star anise oil; storage time ; storage way; weight; antimicrobial activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702040

碩士，講師(本文通訊作者，E-mail:liping790520@126.com)。

2016-06-20，改回日期：2016-07-19

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃項目(14JCQNJC06300)；2016年天津市大學生創新創業訓練計劃項目(201610061067)