細(xì)菌纖維素管的發(fā)酵條件優(yōu)化及結(jié)構(gòu)性能研究

湯衛(wèi)華，賈士儒

1(天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，天津，300350) 2(天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

細(xì)菌纖維素管的發(fā)酵條件優(yōu)化及結(jié)構(gòu)性能研究

湯衛(wèi)華1，賈士儒2*

1(天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，天津，300350) 2(天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457)

木醋桿菌是一種革蘭氏陰性專性需氧菌，采用透氣管材硅膠管作為發(fā)酵容器生產(chǎn)細(xì)菌纖維素(Bacterial Cellulose, BC)管，實(shí)驗(yàn)中考察發(fā)酵培養(yǎng)基種類、發(fā)酵時(shí)間、接種量對(duì)BC管產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，最適發(fā)酵時(shí)間為6 d，發(fā)酵培養(yǎng)基為復(fù)合培養(yǎng)基，最適接種量為4 %(v/v)。采用FTIR、XRD對(duì)BC管的結(jié)構(gòu)性能進(jìn)行表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BC管的結(jié)晶度稍低于BC膜，BC管的拉伸性能達(dá)到50.25 MPa，與BC膜相當(dāng)。采用原子力顯微鏡(AFM)觀察BC管的微觀形貌，發(fā)現(xiàn)BC管是由纖維束高度纏繞而形成，與BC膜相比，BC管的纖維束大小相差較大，這也可能是造成BC管在結(jié)晶度和拉伸性能上稍低于BC膜的原因。該研究可為BC管在高附加值的食品包裝材料、組織工程支架材料等的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

細(xì)菌纖維素管；發(fā)酵條件；優(yōu)化；性能表征

細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose，BC)是某些細(xì)菌合成的高分子化合物，具有超精細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，雖然BC和植物或海藻產(chǎn)生的纖維素具有相同的分子結(jié)構(gòu)單元，但BC卻具有很多獨(dú)特的性質(zhì)如高結(jié)晶度、高化學(xué)純度、高抗張強(qiáng)度、高彈性模量、高持水性、良好的生物相容性、生物合成的可調(diào)控性等[1-2]，這些性質(zhì)是其他來(lái)源的纖維無(wú)法比擬的。

基于BC生物合成具有可調(diào)控性，很多研究者探索不同發(fā)酵技術(shù)和方法合成管狀BC，如BODIN[3]等人采用2種不同的發(fā)酵技術(shù)合成BC管，并探討其作為組織工程支架血管的潛力；KLEMM[4]采用圓柱形玻璃基 (cylindrical glass matrix)作為發(fā)酵容器， BC管在玻璃基間隙形成。管狀細(xì)菌纖維素的出現(xiàn)，不僅可以豐富細(xì)菌纖維素的品種，同時(shí)可以拓展細(xì)菌纖維素的應(yīng)用領(lǐng)域。管狀細(xì)菌纖維素將在高附加值食品包裝和組織工程支架材料如人造血管和人工食管等上具有應(yīng)用潛力。

作者在前期也進(jìn)行了大量的BC管的研究，比較2種發(fā)酵細(xì)菌纖維素管的模式，從發(fā)酵效率等方面確定發(fā)酵模式2為生產(chǎn)BC管的最適方法[5]。在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)BC管的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)BC管性能進(jìn)行的表征，以期全面把握BC管的性能，有利于其推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 菌種和主要的材料

木葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacteroboediens)，工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。硅膠管(Φ9 mm×6 mm、Φ16 mm×12 mm、Φ20 mm×16 mm、Φ25 mm×20 mm、Φ31 mm×25 mm)：市售。

1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌纖維素合成培養(yǎng)基是在SON等人[6]優(yōu)化的合成培養(yǎng)基上進(jìn)行修改的，培養(yǎng)基組成(g/L)：葡萄糖 25，(NH4)2SO410， Na2HPO43.5， KH2PO41，MgSO4·7H2O 1.0， FeSO4·7H2O 0.015，煙酸 0.003，生物素 0.02，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

細(xì)菌纖維素復(fù)合培養(yǎng)基組成(g/L): 葡萄糖 25，酵母粉 7.5，蛋白胨 10，Na2HPO410，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 BC管和BC膜的制備

1.3.1 BC 管的制備

在滅過(guò)菌的硅膠管中倒?jié)M發(fā)酵培養(yǎng)基，以6%(v/v)的比例接入種子培養(yǎng)基，然后用膠塞將管材兩端密封。在30 ℃下靜置培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)菌纖維素管從管材中取出[5]。

1.3.2 BC膜的制備

以6%(v/v)的接種量接入液體培養(yǎng)基(500 mL的錐形瓶盛有100 mL液體培養(yǎng)基)，接種時(shí)需充分振蕩，以使菌液均勻，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)6 d。

1.4 細(xì)菌纖維管提取和處理方法

培養(yǎng)結(jié)束后，從硅膠管內(nèi)BC管取出，用水多次沖洗，除去管表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)。再將管浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液中，100 ℃煮沸20 min，去除液管中的菌體和殘留培養(yǎng)基，管呈乳白色半透明。然后用蒸餾水多次沖洗，用pH試紙輕壓膜測(cè)pH值，約7.2。80 ℃干燥至恒重，進(jìn)行稱重。

1.5 原子力顯微鏡(AFM)

BC膜和BC管的表面形貌采用原子力顯微鏡((JSPM-5200, Japan)觀察。掃描模式為輕敲模式，通過(guò)自動(dòng)平滑和低通濾波處理消除慢掃的低頻噪音。

1.6 紅外光譜(FTIR)

采用傅立葉變換紅外光譜儀VECTOR 22來(lái)進(jìn)行，波長(zhǎng)掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.7 X-射線衍射(XRD)

采用X-射線衍射儀(X-ray diffractometer)，Rigaku(日本理學(xué)株式會(huì)社)，D/max-250。將BC膜和BC管平整固定在框架上，Cu靶，10 kV高壓，管流100 mA，進(jìn)行2θ=5～40°大范圍掃描。結(jié)晶度(C.I)的計(jì)算公式(1)計(jì)算[7]：

式中：I020，晶格衍射的最高強(qiáng)度值;Iam是2θ=18°的強(qiáng)度值。

1.8 拉伸性能

用微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(RG-5)來(lái)測(cè)定BC膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率，首先截取長(zhǎng)度為10 cm、寬度為1 cm的BC，速度為5 mm/s，當(dāng)BC片拉伸后開(kāi)始記錄為零應(yīng)力。使用CH-1-SST型塑料薄膜薄片測(cè)厚儀測(cè)定BC膜的厚度。拉伸強(qiáng)度公式(2)計(jì)算：

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 BC管發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 不同的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)BC管生物合成的影響

考察復(fù)合培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基對(duì)BC管生物合成的影響，采用硅膠管(Φ16 mm×12 mm)為發(fā)酵容器，以6 %(v/v)的接種量接入培養(yǎng)基中，在30 ℃下培養(yǎng)6 d。結(jié)果如表1所示。

表1的結(jié)果表明，復(fù)合培養(yǎng)基中形成的BC管產(chǎn)量及厚度均高于合成培養(yǎng)基。這可能是木葡糖酸醋桿菌在復(fù)合培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好，而木葡糖酸醋桿菌的生長(zhǎng)與細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量相偶聯(lián)。因此在復(fù)合培養(yǎng)基中合成的BC管厚度和產(chǎn)量高于合成培養(yǎng)基中。

表1 不同的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)合成BC管的影響

2.1.2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)BC管生物合成的影響

采用硅膠管(Φ20 mm×16 mm)為發(fā)酵容器，以6 %(v/v)的接種量接入培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下培養(yǎng)，考察不同的培養(yǎng)時(shí)間1、2、4、6、8 d對(duì)BC管生物合成的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 不同的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)BC管生物合成的影響

表2的結(jié)果表明，木葡糖酸醋桿菌在培養(yǎng)的第6天生物合成的細(xì)菌纖維素管產(chǎn)量最高，同時(shí)菌體量也達(dá)到最高值。確定生物合成BC管的時(shí)間為6 d。

2.1.3 接種量對(duì)BC管生物合成的影響

采用硅膠管(Φ20 mm×16 mm)為發(fā)酵容器。接種量分別為2 %、4 %、6 %、8 %(v/v)。在30 ℃下培養(yǎng)6 d，結(jié)果如圖1所示。

圖1 接種量對(duì)BC管生物合成的影響Fig.1 Effect of inoculums volume on BC tubes

圖1的結(jié)果表明，接種量對(duì)木葡糖酸醋桿菌合成細(xì)菌纖維素管的產(chǎn)量影響不大，其中接種量為4 %～8 %(v/v) 區(qū)間，BC產(chǎn)量非常接近，綜合考慮， BC管的生物合成的最適接種量為4 %(v/v)。

2.1.4 不同管徑BC管的生物合成

采用不同管內(nèi)徑(Φ9 mm×6 mm、Φ16 mm×12 mm、Φ20 mm×16 mm、Φ25 mm×20 mm、Φ31 mm×25 mm)的硅膠管作為發(fā)酵容器，在優(yōu)化條件下(接種量4 %、復(fù)合培養(yǎng)基和發(fā)酵時(shí)間6 d)生物合成BC管，結(jié)果如圖2所示。

(a)管內(nèi)徑為6、12、16、20、25 mm的BC管的橫切面(b)管內(nèi)徑為25 mm的BC管全貌圖2 不同管徑BC管的生物合成Fig.2 Digital images of BC tubes with different diameters

由圖2可知，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，不同的管徑中均能形成BC管，具體看的BC管橫切面圖，如圖2(a)。同時(shí)也可以看到形成的BC管是均勻的，見(jiàn)圖2 (b)。這說(shuō)明，采用硅膠管作為發(fā)酵容器，在接種量4 %(v/v)、復(fù)合培養(yǎng)基和發(fā)酵時(shí)間6 d的條件下，在不同的管徑中均能合成均勻的BC管。

2.2 BC管的結(jié)構(gòu)性能

2.2.1 紅外光譜(FTIR)

由BC管的紅外光譜譜圖可知(圖3)，位于1 060 cm-1為C—O—C和C—O—H鍵的伸縮振動(dòng)引起的，是纖維素的特征吸收峰；在3 350 cm-1處的吸收峰，反映了O—H鍵的伸縮振動(dòng)；2 895 cm-1處的吸收峰則是由O—H鍵的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的；在1 428 cm-1處的吸收峰是由C—H鍵彎曲振動(dòng)引起的，深度與纖維素結(jié)晶度有關(guān)；在1 200～1 500 cm-1之間出現(xiàn)多個(gè)吸收峰，主要是—CH，—CH2以及OH的彎曲與搖擺振動(dòng)引起的。在897 cm-1的吸收峰是糖苷鍵的特征峰。SUGIYAMA[8]等認(rèn)為在600～800 cm-1區(qū)域之間的吸收峰，由于存在很多重疊以及不同峰之間的極化現(xiàn)象，造成該區(qū)域的吸收峰不明確，因此通常很難解釋。

圖3 BC管的FTIR譜圖Fig.3 FTIR spectra of BC tube

2.2.2 X-射線衍射(XRD)

纖維素X-射線衍射圖譜是以衍射角為橫坐標(biāo)，衍射強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以晶胞(1-10)，(110)和(020)面的衍射峰為計(jì)算基準(zhǔn)，其他位置的衍射峰與結(jié)晶度計(jì)算關(guān)系不大[9]。圖4中BC管和BC膜是典型的細(xì)菌纖維素XRD圖譜，沒(méi)有明確的結(jié)晶銳衍射和非晶漫散射之分，有的只是介乎它們之間的寬化衍射峰。說(shuō)明在細(xì)菌纖維素中不存在單一的、明確的結(jié)晶相和非晶相，而是在晶態(tài)和非晶態(tài)之間存在一種整體的有序度變化。同時(shí)從XRD譜圖發(fā)現(xiàn)BC膜和BC管具有極其相似的衍射峰分布，BC膜的3個(gè)主要衍射峰位于14.580、16.800和22.620，BC管的3個(gè)主要衍射峰位于14.460、16.520和22.680，分別對(duì)應(yīng)于晶面(1-1 0)， (1 1 0)和 (0 2 0)，如圖4所示，這與前人的結(jié)論非常相似[10-12]。

圖4 BC管和BC膜的XRD譜圖Fig.4 XRD patterns of BC tube and BC membrane

樣品結(jié)晶度/%2θ(d(1,-1,0))2θ(d(110))2θ(d(020))BC膜83.914.580(6.07)16.800(0.282)22.620(0.941)BC管82.614.460(6.12)16.520(5.36)22.680(3.91)

由表3可知，BC管和BC膜均有較高的結(jié)晶度，分別為82.6 %和83.9 %，BC膜的結(jié)晶度稍高于BC管。 這說(shuō)明BC管在結(jié)晶度上已達(dá)到普通BC膜的水平。

2.2.3 BC管的微觀形貌

BC管的微觀形貌與在相同條件下制備的BC膜相比較，結(jié)果如圖5所示。

(a)BC管(50 000×); (b) BC膜(50 000×)圖5 BC管和BC膜的微觀形貌圖Fig.5 Graphs of BC tube and BC membrane

由圖5(a)可知，BC管通過(guò)纖維束相互纏繞而形成，其表面較為致密。與BC膜相比，BC管的表面致密度和均勻度均低于BC膜，同時(shí)BC管的纖維束粗細(xì)相差很大，而B(niǎo)C膜的纖維束粗細(xì)比較均勻，見(jiàn)圖5(a)和(b)。這可能是BC管和BC膜結(jié)構(gòu)性能存在一些差異的原因。

2.2.4 拉伸性能

采用微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)測(cè)定BC膜和BC管的拉伸強(qiáng)度，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 BC管與BC膜的拉伸性能Fig.6 Tensile strength of bacterial cellulose tube and bacterial cellulose membrane

在相同發(fā)酵條件(接種量4 %、復(fù)合培養(yǎng)基和發(fā)酵時(shí)間6 d)下，制備得到的BC管和BC膜拉伸強(qiáng)度相當(dāng)，BC管的拉伸強(qiáng)度達(dá)到50.25 MPa。這說(shuō)明BC管也具有良好的拉伸性能。

3 結(jié)論

采用硅膠管作為發(fā)酵容器培養(yǎng)木醋桿菌生產(chǎn)細(xì)菌纖維素管，其最適發(fā)酵條件時(shí)是發(fā)酵時(shí)間為6 d，發(fā)酵培養(yǎng)基為復(fù)合培養(yǎng)基，接種量為4 %(v/v)。采用FTIR、XRD和微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)對(duì)BC管的結(jié)構(gòu)性能進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)BC管具有纖維素的特征峰，結(jié)晶度達(dá)到82.6%，拉伸強(qiáng)度為50.25 Mpa。采用AFM對(duì) BC管的微觀形貌進(jìn)行觀察， BC管是由纖維束高度纏繞而形成，構(gòu)成BC管的纖維束尺寸差異較大，而B(niǎo)C膜的較為均勻，其原因有待進(jìn)一步研究。

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Optimization of fermentation conditions for bacterial cellulose tube and study on its structure performance

TANG Wei-hua1, JIA Shi-ru2*

1(Department of Chemical Biology, Tianjin Modern Vocational Technology College, Tianjin 300350, China)2(Key Laboratory of Tianjin Industrial Microbiology, Tianjin 300457, China)

Acetobacterxylinumare γ-negative, aerobic, rod-shaped bacteria. Bacterial cellulose (BC) tube was produced by fermentingAcetobacterxylinumon inner surface of oxygen-permeable silicone tube. The effects of culture medium, fermentation time, and inoculum on the yield of BC tube were studied. The culture medium was complex culture.The maximum BC tube concentration was achieved after culture with 4 %(v/v) inoculums for 6 days. The bacterial cellulose tube was characterized by FTIR and XRD. The crystallinity index of the BC tubes was 82.6 %, which was slightly lower than the value of BC membrane. Tensile strengths of BC tubes were 50.25 MPa, which was close to the value of BC membrane. The morphology of the tubes was characterized by Atomic Force Microscope (AFM).Results revealed that BC tube was synthesized in the form of microfibrils creating highly entangled network of micro-and nanofibers.Compared with BC membrane, microfibrils of BC tubes had significant differences in geometrical dimensions. This may be able to explain why the crystallinity and tensile properties of BC tube were slightly lower than BC membrane. The experiment results can provide basic data for the application of BC tube on high value-added food packaging materials and tissue engineering scaffolds.

bacterial cellulose tube; fermentation condition; optimization; structure performance

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702007

博士研究生，教授(賈士儒教授為通訊作者)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21106105)

2016-07-28，改回日期：2016-10-08