中間代謝產物對白色鏈霉菌ε-聚賴氨酸合成的影響

賴永勤，曾天府，熊瑞，郭詩琪，劉丹丹，李學如

(西南交通大學 生命科學與工程學院，四川 成都，610031)

中間代謝產物對白色鏈霉菌ε-聚賴氨酸合成的影響

賴永勤，曾天府，熊瑞，郭詩琪，劉丹丹，李學如*

(西南交通大學 生命科學與工程學院，四川 成都，610031)

探討白色鏈霉菌ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)生物合成過程中，中間代謝產物檸檬酸、L-天冬氨酸和L-賴氨酸對ε-PL合成的影響。單因素實驗結果表明，在搖瓶發酵開始(0 h)添加檸檬酸至終質量濃度為1.0 g/L，培養到12 h分別添加終質量濃度為0.3 g/L 的L-天冬氨酸和終質量濃度為1.0 g/L 的L-賴氨酸，可分別提高ε-PL產量42.5%、28.7%和44.1%。正交試驗顯示，只有檸檬酸和L-賴氨酸對ε-PL合成影響顯著(P<0.05)，而L-天冬氨酸影響不顯著；在培養基中添加1.0 g/L的檸檬酸和L-賴氨酸ε-PL產量可提高60.1%。在破碎的無細胞體系中，只有添加L-賴氨酸可以檢測到ε-PL的生成，進一步證實了L-賴氨酸是ε-PL合成的直接前體。因此，通過添加合適的中間代謝產物，可以有效提高ε-PL產量。

中間代謝產物；ε-聚賴氨酸；生物合成；白色鏈霉菌

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是一種非核糖體合成的25～30個L-賴氨酸(L-Lysine,L-Lys)單體通過ε-氨基和α-羧基聚合而成的賴氨酸同型聚合物[1]，盡管在芽孢桿菌屬和一些絲狀真菌中也發現能產生天然ε-PL的菌株，但只有某些鏈霉菌具有發酵生產ε-PL工業開發價值[2]。由于ε-PL具有廣譜抑菌活性，對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌和病毒都有高效抑制作用，在高溫、酸、堿條件下都能穩定存在和安全無毒等優點，目前已被中國、日本、美國、韓國等國家正式批準作為食品添加劑進入市場[3-4]。此外，ε-PL還可作為藥物載體、細胞促溶劑、親水凝膠和電子元器件的制作材料，用于醫藥、化工和環保材料等領域[5-6]，因此ε-PL具有十分廣闊的市場應用前景。

發酵法生產ε-PL的成本是制約其大規模作為食品添加劑應用的關鍵因素，提高發酵法生產ε-PL效率是降低生產成本的核心。目前ε-PL的相關研究主要集中在生產菌株篩選與育種，發酵工藝優化等方面[7]，但從已報道的文獻中，ε-PL 的代謝途徑及合成機理已初見端倪。1983年SHIMA等[8]利用放射性同位素標記法對L-Lys中的14C進行標記，證明了Streptomycesalbulus以L-Lys作為合成ε-PL的前體物質；2007 年，HAMANO 等[9]推測ε-PL 的前體物質L-Lys可能是通過二氨基庚二酸途徑合成的；SANDIP 等[10]向培養基中添加屬于三羧酸循環( TCA) 的多種有機酸時，只檸檬酸能夠有效促進ε-PL 的生產，而琥珀酸則抑制ε-PL 的生產，因此推測草酰乙酸轉變為L-天冬氨酸(L-Aspartic,L-Asp)的節點為ε-PL 代謝的關鍵節點，ε-PL的前體物質L-Lys主要通過L-Asp代謝支路合成。為此，本研究選擇三羧酸循環中間產物檸檬酸，L-Asp代謝支路生成L-Lys中間產物L-Asp和ε-PL聚合酶底物L-Lys，通過單因素和正交試驗的方法，研究ε-PL合成的這些重要中間代謝產物對ε-PL合成的影響，以期獲得ε-PL發酵中間產物添加的合適時間及其濃度，達到提高ε-PL產量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

白色鏈霉菌CI108(Streptomycesalbulus),本實驗室分離獲得。

1.1.2 主要試劑

ε-PL標準品、L-賴氨酸和L-天門冬氨酸(Sigma公司)；檸檬酸(廣東光華科技股份有限公司)，甲基橙(成都科龍化工公司)。

1.1.3 發酵與種子(M3G)培養基(%)

葡萄糖5.0， 酵母粉0.5， (NH4)2SO41.0，KH2PO4·7H2O 0.136，K2HPO4·7H2O 0.08，MgSO4·7H2O 0.05，ZnSO4·7H2O 0.004，FeSO4·7H2O 0.003，pH 6.8，121 ℃滅菌20 min[11]。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法

種子培養[4]：從斜面挑取 1 環孢子接入滅菌后的種子培養基中(30 mL /250 mL) ， 30 ℃，200 r/min條件下搖瓶培養24 h。

發酵培養：將種子液以8%的接種量接種于發酵培養基中(60 mL /500 mL)，30 ℃，200 r/min 條件下搖瓶培養，根據實驗要求添加中間代謝產物檸檬酸、L-Asp和L-Lys。

1.2.2 中間代謝產物對ε-PL合成影響

不同時間添加中間代謝產物對ε-PL合成影響：接種種子液后分別在發酵不同時間(0、12、24、36、48、60 h)添加檸檬酸、L-Asp和L-Lys，以獲得其最佳添加時間。

不同濃度的中間代謝產物對ε-PL合成影響：在發酵培養過程的最佳添加時間設置不同濃度組，各單因素水平表見表1。在進行單因素試驗，探討其中一個因素時，其他各因素水平為0，即不添加。

表1 中間代謝產物質量濃度單因素試驗水平表

正交試驗分析代謝產物對ε-PL合成影響：在單因素試驗基礎上，通過4因素3水平[L9(34)]正交試驗，確定中間產物的最佳添加工藝。

1.2.3 中間代謝產物在無細胞體系中對ε-PL合成影響實驗

細胞破碎方法：參考文獻[12]稍作修改。菌株CI108發酵至24 h時，無菌條件下將三角瓶中菌體和發酵液全部轉入50 mL離心管，離心棄上清液；用磷酸緩沖液洗滌菌體，再離心棄上清液，重復洗滌1次；再用磷酸緩沖液重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎(260 W，破2 s停2 s，工作時間10 min)后離心收集上清液。分別向各組細胞破碎上清液中添加檸檬酸、L-Asp和L-Lys，以上清液為空白對照；繼續搖瓶培養一定時間，測定其中ε-PL含量。

1.3 發酵參數測定

1.3.1 生物量的測定

發酵液10 000×g 離心10 min，棄上清液，去離子水洗滌菌體，再離心棄上清液，重復洗滌1次，沉淀連同已恒重的離心管置于30 ℃ 烘箱烘干至恒重，兩者之差為菌體干重[13]。

1.3.2 ε-PL含量的測定

據ITZHAKI[14]的方法稍作修改，發酵液8 000 r/min 離心10 min去除菌體，將上清液用0.1 mol/L磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.6)稀釋至標準曲線線性范圍。取稀釋液10 mL與10 mL甲基橙溶液(1 mmol/L)混合，30 ℃ 200 r/min振蕩反應30 min，然后12 000 r/min 離心15 min除去產生的ε-PL-甲基橙復合物。用磷酸緩沖液將上清稀釋20倍，以磷酸緩沖液為空白對照，分光光度計測定465 nm的吸光值，通過標準曲線方程y=-0.601 1x+0.420 4，R2=0.999 0計算ε-PL的質量濃度。

1.4 統計學方法

試驗所得數據以Orign8、GraphPad Prism 6進行分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株CI108發酵生產ε-PL動力學

在菌株CI108發酵培養過程中，每隔6 h取樣測定發酵液中細胞干重和代謝產物ε-PL含量。以細胞干重和ε-PL含量為縱坐標，培養時間為橫坐標，獲得菌株CI108生長與發酵生產ε-PL曲線圖(圖1)。

圖1 菌株CI108搖瓶發酵產ε-PL過程菌體生長曲線及ε-PL生成曲線Fig.1 Time profiles of cell, ε-PL biosynthesis in flask cultivation of Strain108 for the production of ε-PL

如圖1表明，接種種子后，菌體生長很快進入對數生長期，當發酵培養30 h左右，菌體生長進入穩定期，穩定期持續到發酵培養66 h后，菌體的生長逐漸進入衰退期。菌株CI108發酵生產ε-PL的動態曲線(圖1)表明菌體對數生長前期(12 h前)幾乎不產生ε-PL，12 h以后開始形成ε-PL，從18 h到54 h，菌株產生ε-PL生產率為高峰期，以后生產率增長逐漸減少，到發酵72 h后，發酵液中ε-PL不再增加。進一步分析菌株CI108生長與發酵生產ε-PL關系發現，菌體在對數生長中期，開始在發酵液中檢測到ε-PL存在；在菌體生長的穩定期一直維持較高ε-PL生產率，以后菌株的ε-PL生產率逐漸下降，在衰退期不再形成ε-PL。菌株CI108生長繁殖過程中合成ε-PL的規律符合次生代謝產物合成特征。基于添加次生代謝前體物質有助于次生代謝產物合成的理論，選擇ε-PL合成中間產物檸檬酸，L-Asp和L-Lys，研究這3個重要中間產物對ε-PL合成的影響。

2.2 中間代謝產物的添加時間和濃度

2.2.1 檸檬酸最適添加時間及濃度

檸檬酸是生物體通過三羧酸循環獲得ATP的重要中間代謝產物，ATP為ε-PL合成所必需[15]。為了獲得發酵不同時間添加檸檬酸對ε-PL產量的影響，在發酵開始以及每隔 12 h向不同發酵液中添加終濃度1.0 g/L 檸檬酸，培養至72 h取出測定發酵液中ε-PL含量，結果圖2(a)所示。

圖2 添加檸檬酸對菌株發酵生產ε-PL的影響Fig.2 Effects of additional citric acid on ε-PL*：表示P<0.05，具顯著性差異，**：表示P<0.01，***：表示P<0.001，具有極顯著性差異(下同)。

在發酵開始到36 h添加檸檬酸，都能提高菌株ε-PL的產量，尤其在發酵開始時添加，效果最為明顯，培養48 h以后添加檸檬酸不利于ε-PL的形成。前期培養基中添加除了菌體能利用的檸檬酸，有利于形成更多的ATP和代謝產物中間體外，還有一個原因可能是檸檬酸的加入，發酵液pH值下降，使發酵液適合ε-PL的大量積累的酸堿度提前，促使ε-PL合成期延長，而發酵后期發酵液已經達到ε-PL大量積累的合適酸堿度，此時添加檸檬酸會使發酵液pH值進一步下降，不利于ε-PL的積累，因為ε-PL生物合成與pH關系十分密切，其最適pH范圍3.0～4.0[13]。

在發酵培養開始分別添加0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g/L的檸檬酸對菌株產ε-PL影響研究結果如圖2(b)，檸檬酸濃度在0.5～1.5 g/L范圍，都能顯著提高ε-PL產量，以添加1.0 g/L提高最大，與不添加檸檬酸相比，ε-PL產量可提高42.5%。

2.2.2L-Asp最適添加時間與濃度

天冬氨酸激酶是賴氨酸合成的關鍵酶之一，通過化學誘變篩選到高活性天冬氨酸激酶突變株，能顯著提高ε-PL產量[7]，因此，SHIMA[8]等推測 ε-PL的單體L-Lys來源于二氨基庚二酸途徑，草酰乙酸轉變為L-Asp為ε-PL代謝的關鍵節點之一。為了確定L-Asp添加時間對ε-PL合成的影響，在發酵培養0、12、24、36、48、60 h，向不同三角瓶的發酵液中添加終質量濃度為0.3 g/L 的L-Asp，發酵培養至72 h，測定發酵液中ε-PL含量，實驗結果圖3(a)所示，在發酵開始到24 h添加L-Asp，都能提高菌株ε-PL的產量，尤其在發酵12 h添加，效果最為明顯。

圖3 添加L-Asp對菌株發酵生產ε-PL的影響Fig.3 Effects of additional L-Asp on ε-PL

發酵后期添加L-Asp不利于ε-PL合成，推測其可能原因之一是，在ε-PL合成途徑中，菌體自身以三羧酸循環代謝中間產物草酰乙酸為底物形成天冬氨酸[10]，發酵后期菌體自身代謝產天冬氨酸足以供菌體合成ε-PL所需，此時過剩的天冬氨酸反饋抑制三羧酸循相關過程，使ATP供應不適，而ε-PL合成與ATP有密切關系[15]；但關于其具體作用機制還有待進一步實驗研究。

L-Asp合適添加濃度研究結果圖3(b)顯示，在發酵培養至12 h添加0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/L的L-Asp都能提高ε-PL的產量，最合適添加質量濃度為0.3 g/L，與不添加相比，ε-PL產量可提高28.7%。

2.2.3L-Lys最適添加時間與濃度

研究表明，ε-PL是一種生物體在ε-PL聚合酶作用下，非核糖體合成的L-Lys聚合物，考察不同時間添加L-Lys對ε-PL合成影響研究結果圖4(a)所示。在發酵培養0～36 h添加2.0 g/L 的L-Lys都能有效提高菌株ε-PL合成能力，以發酵培養12 h時添加為最適。發酵培養至48 h左右，此時菌體生長已進入穩定中期(圖1)，添加L-Lys，會使ε-PL的產量有所下降，可能是這一時期，菌體產生L-Lys足以滿足ε-PL聚合酶合成ε-PL，此時添加L-Lys造成底物過量，對ε-PL聚合過程產生底物抑制作用，進一步抑制ε-PL的合成，底物抑制現象在微生物法生產二羥丙酮[16]，發酵法合成正丁醇[17]，青霉素擴環酶[18]等的研究中均有體現；而ε-PL聚合過程的底物抑制作用機制還需更深入地研究探討。

圖4 添加L-Lys對菌株發酵生產ε-PL的影響Fig.4 Effects of additional L-Lys on ε-PL

在發酵培養12 h，添加不同濃度的L-Lys研究結果圖4(b)所示，發酵液中添加0.5～2.5 g/L的L-Lys，都能顯著促進菌株ε-PL合成，當添加L-Lys濃度為1.0 g/L， ε-PL產量提高最大，與不添加相比可提高44.1%的ε-PL。

2.3 檸檬酸、L-Asp和L-Lys對ε-PL合成的影響正交試驗結果

在單因素實驗的基礎上，利用正交試驗研究檸檬酸、L-Asp和L-Lys對ε-PL合成的影響，正交試驗因素與水平如表2。

表2 正交試驗因素水平表

注：“-”表示不添加任何物質。

實驗結果及極差(R)分析(表3)顯示，各因素對ε-PL合成的影響大小順序為：RL-Lys>R檸檬酸>RL-Asp>R空列。L-Lys極差(R=0.34)、檸檬酸極差(R=0.32)和L-Asp極差(R=0.16)遠遠大于誤差項極差(R=0.07)，說明檸檬酸、L-Asp和L-Lys對ε-PL產量都有一定影響。

表3 正交試驗結果及極差分析

進一步對實驗數據進行方差分析結果如表4所示，只有檸檬酸和L-Lys對ε-PL產量具有顯著性影響，L-Asp對ε-PL產量影響不顯著。L-Asp單獨添加可增強ε-PL合成，而與檸檬酸和L-Lys混合添加影響不顯著的原因，我們推斷可能是由于L-Lys是ε-PL合成首要限制因子，單獨添加L-Asp在發酵培養基中，有利于L-Lys合成，因而能促進ε-PL合成，在添加了L-Lys的發酵培養基中，L-Lys已不是限制因子，此時再添加L-Asp對ε-PL合成不再有促進作用。在添加了L-Lys的發酵培養基中，添加檸檬酸還能顯著提高ε-PL產量印證了檸檬酸的加入使菌體獲得更多的能量ATP和使發酵液pH值提前下降到ε-PL合成合適環境的結論。

表4 正交試驗結果方差分析

注：F0.10(2, 2)=9.00 F0.05(2, 2)=19.00 F0.01(2, 2)=99.00.

正交試驗極差和方差分析均表明L-Asp對ε-PL合成影響甚小，而檸檬酸和L-Lys在質量濃度均為1.00 g/L時效果最佳，故確定添加中間產物的適宜方案：發酵培養開始時添加1.00 g/L檸檬酸和發酵培養12 h添加1.00 g/LL-Lys。

在確定適宜添加方案下，進行3批次的驗證實驗，結果見圖5，ε-PL平均產量達到 3.03 g/L，獲得比不添加中間產物時ε-PL產量提高60.1%。

2.4 中間代謝產物在無細胞體系中對ε-PL合成的影響

將白色鏈霉菌CI108在發酵培養基中培養24 h，離心，超聲波破碎細胞，離心獲得細胞提取酶液，取等量細胞破碎提取液分別添加1.0 g/L的L-Lys、0.3 g/L的L-Asp和1.0 g/L檸檬酸，以提取液為空白對照，30 ℃繼續搖床培養4 h，測定細胞破碎液中ε-PL含量。結果只有添加L-Lys的實驗組檢測到了0.69 g/L的ε-PL，而添加天冬氨酸和檸檬酸在此酶體系中無法檢測到ε-PL存在；實驗結果再一次表明，中間代謝產物L-Lys可以在無細胞體系中合成ε-PL。

3 結論

本研究通過控制中間代謝產物調控ε-PL的生物合成考慮，考察檸檬酸、L-Asp和L-Lys對ε-PL合成的影響。結果表明通過控制添加檸檬酸、L-Asp和L-Lys的時間和濃度可有效提高ε-PL產量。當同時添加3種中間代謝產物時，只有檸檬酸和L-Lys對ε-PL產量的提高具有顯著性。結合在鏈霉菌無細胞體系中只有添加L-Lys能合成ε-PL，表明L-Lys是ε-PL合成首要限制因子，任何能提高L-Lys產量的措施，都可能有效提高ε-PL產量。當然關于ε-PL的生物合成途徑中的關鍵化合物和酶系目前仍然還不十分清楚，有待進一步的研究。

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Effect of intermediate metabolites on ε-poly-lysine biosynthesis inStreptomycesalbulus

LAI Yong-qin, ZENG Tian-fu, XIONG Rui, GUO Shi-qi, LIU Dan-dan, LI Xue-ru*

(School of Life Science and Engineering, SouthwestJiaotong University, Chengdu 610031,China)

Influences of intermediate metabolites, citric acid,L-Aspartic acid andL-Lysine on the biosynthesis of ε-poly-lysine (ε-PL) were studied. Single factor tests indicated that addition of 1.0 g/L citric acid at the start of fermentation and addition of 0.3 g/LL-Aspartic acid and 1.0 g/LL-Lysine at 12 h of fermentation could increase production of ε-PL to 42.5%, 28.7% and 44.1%, respectively. Results of orthogonal test showed that onlyL-Lysine and citric acid affected the production of ε-PL significantly (P<0.05), whileL-Aspartic acid not. Feeding 1.0 g/L citric acid andL-Lysine into culture would improve production of ε-PL to 60.1%. Results of cell-free system experiment showed that ε-PL was detected only inL-Lysine feeding group, which further suggested thatL-Lysine was immediate precursors of ε-PL. Therefore, production of ε-PL could be improved effectively by addition of intermediate metabolites appropriately.

intermediate metabolites; ε-poly-lysine; biosynthesis;Streptomycesalbulus

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702006

碩士研究生(李學如教授為通訊作者，xueruli@sina.com)。

四川省科技支撐項目(2012FZ0048)和國家大學生創新創業訓練計劃項目(批準號：201610613064) 資助

2016-06-23，改回日期：2016-08-29