微波水熱法降解殼聚糖的研究

武泰恒, 邵 謙, 趙雯麗

(山東科技大學 化學與環境工程學院，山東 青島 266590)

微波水熱法降解殼聚糖的研究

武泰恒, 邵 謙, 趙雯麗

(山東科技大學 化學與環境工程學院，山東 青島 266590)

在H2O2和α-淀粉酶存在的條件下，使用微波水熱法，在低濃度醋酸溶液中快速降解殼聚糖。研究了醋酸濃度、H2O2和α-淀粉酶用量以及微波水熱時間對殼聚糖降解的影響，并利用FTIR對降解的殼聚糖進行了分析。結果顯示，在V(H2O2):m(殼聚糖) =2 mL/g，m(殼聚糖):m(α-淀粉酶)=3的條件下，40 ℃微波水熱反應40 min，即可使殼聚糖粘均分子量下降99.8 %以上，而用普通水熱法達到相同分子量則需約9 h，微波水熱法大大提高了降解殼聚糖的效率，同時不破壞殼聚糖本身的結構，是一種高效環保的殼聚糖降解方法。

殼聚糖；微波水熱；降解；H2O2；α-淀粉酶

殼聚糖 (chitosan) 又被稱作脫乙酰甲殼素，是由自然界中相當普遍的幾丁質 (chitin) 脫乙酰化而得到的，化學名稱為聚葡萄糖胺 (1-4)- 2- 氨基-B-D 葡萄糖。自1859年法國人Rouget第一次得到殼聚糖，這類高分子的生物安全性、官能性、微生物降解性、血液相容性等良好的性能就被很多行業廣泛關注[1]，近年來，在食品、醫療、化妝品、化學化工、污水處理、貴重金屬回收、生物工程等方面的應用獲得了突破性進展[2-4]。然而，殼聚糖的分子量從幾十萬到幾百萬甚至上千萬不等，且分子間和分子內部存在著大量氫鍵，因而不易溶于水及一些普通的溶劑，而且難以被人體吸收利用，限制了殼聚糖的應用。

低聚殼聚糖是殼聚糖降解后的產物，有較高的溶解度，易被吸收利用。近些年來，隨著研究的深入，低聚殼聚糖展現出了獨特的生理活性和功能，如抑制腫瘤細胞的轉移和生長、具有明顯的抗菌抑菌效果、降低血脂含量以及膽固醇含量、提高巨噬細胞的功能、促進蛋白質合成、活化植物細胞促進植物生長以及具有顯著的保濕能力等[5]。目前，針對殼聚糖的降解方法大致可以劃分為酸降解法、氧化降解法以及酶降解法，還有通過這三種方法結合而衍生出來的一些切合實際生產應用的復合降解法。酸降解法通常使用強酸作為降解劑，并通過提高酸的濃度來提高降解效率，這種降解方法不僅不好控制并且會導致一系列環境問題。氧化降解法通常使用強的氧化劑，會破壞殼聚糖的官能團如羧基、氨基，甚至會改變殼聚糖的化學結構[6]，所以很少被廣泛使用。而過氧化氫容易控制、環境友好[7-8]，同時產生的自由基能夠攻擊糖單元間的β- (1,4) 糖苷鍵而導致殼聚糖降解，保持殼聚糖原有的由2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖單元和2-乙酰氨基-2-脫氧-D-葡萄糖單元組成的共聚體化學結構。但是使用H2O2降解殼聚糖的降解效率較低，所以一般很少單獨使用[9]。酶降解法具有眾多優點，例如溫和的反應條件、特異性高、不改變殼聚糖結構等[10]，但是特異性酶成本較高，不利于商業應用和大批量生產低聚殼聚糖。

本研究結合了H2O2和酶降解法環境友好的優點，在低醋酸濃度(1%V/V)下用H2O2和價格低廉的α-淀粉酶降解殼聚糖，采用微波水熱法將反應體系置于微波反應釜中進行降解，降解40 min即可使殼聚糖粘均分子量下降99 %以上，大大提高了降解效率。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

主要儀器：XH-800S微波水熱反應儀 (中國北京)，烏氏粘度計 (中國沈陽)，DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器 (中國上海)，Nicolet-380傅里葉變換紅外分析儀 (美國)。

實驗試劑：殼聚糖 (生物純，BR，粘均分子量3.1×107Da)，過氧化氫 (分析純，AR)，α-淀粉酶 (生物純，BR)。

1.2 水熱法降解殼聚糖

向三口燒瓶中加入3 g殼聚糖和300 mL濃度為2 % (V/V)醋酸溶液，同時開動攪拌和加熱，設定水浴溫度為40 ℃，當殼聚糖完全溶于醋酸溶液中時，使用恒壓滴液漏斗逐滴緩慢滴加6 mL的H2O2，并緩慢加入1 g α-淀粉酶，直至全部溶解。然后恒溫反應7 h。反應結束后，將所得溶液烘干，得到深棕色固體，將該固體研磨成粉末狀，即為殼聚糖降解后的產物。測定其脫乙酰度和粘均分子量。

1.3 微波水熱法降解殼聚糖

向三口燒瓶中加入3 g殼聚糖和300 mL濃度為1 % (V/V)醋酸溶液，并按1.2中的方法加入H2O2和α-淀粉酶直至完全溶解。然后將溶液倒入微波水熱反應釜中，將反應釜置于微波水熱儀中，于800 W、40 ℃下分別反應40、60、90、180 min。將所得溶液烘干，得到深棕色固體，將該固體研磨成粉末狀，即為殼聚糖降解后的產物。測定其脫乙酰度和粘均分子量。

1.4 殼聚糖脫乙酰度的測量

用傅立葉變換紅外光譜儀在 4 000～400 cm-1的范圍內掃描降解過后的殼聚糖，所有掃描都在室溫下進行。殼聚糖脫乙酰度按照 Baxter方法計算[11]。

A1320/A1420=0.382 2+0.031 3 (100-DD%)。

(1)

其中：DD為脫乙酰度，A1320為殼聚糖在1 320 cm-1處的吸收峰，A1 420為殼聚糖在1 420 cm-1處的吸收峰。

1.5 殼聚糖粘均分子量的測定

測定高聚物分子量的方法有很多，其中黏度法設備簡單且操作方便，并有很好的實驗精度，是常用的測量高聚物平均分子質量的方法。粘均分子量(MV) 采用烏氏粘度計測定[12]。將殼聚糖樣品溶于 0.2 mol/L 的 CH3COOH/CH3COONa 緩沖溶液中，通過烏式粘度計在溫度 (25±0.5) ℃下測得流出時間 (ts) 和溶劑的流出時間 (t0)。其中，特性粘度 [η] 通過以下公式計算：

(2)

(3)

ηsp=ηr-1。

(4)

其中：ηr為相對粘度，ηsp為增比粘度，c為殼聚糖溶液的濃度。

根據特性粘度[η]，粘均分子量MV可以利用Mark-Houwink方程式[13]求得。

(5)

其中，K= 1.64×10-30×DD14。

(6)

α= -1.02×10-2×DD+1.82。

(7)

圖1 殼聚糖降解前后的FTIR光譜

圖2 醋酸濃度c與殼聚糖溶液特性粘度[η]的關系圖

式中DD為殼聚糖脫乙酰度的百分比表示形式[14]。

2 結果與討論

2.1 FTIR光譜分析

未降解的殼聚糖和降解后的殼聚糖FTIR光譜如圖1所示。在>3 000 cm-1處是殼聚糖—OH 和—NH—的一個強的伸縮振動吸收峰，在1 656 cm-1處是—NH2中的N—H彎曲振動峰和酰胺Ⅰ帶吸收峰[15]，1 320 cm-1處出現的吸收峰是N-乙酰氨基葡萄糖特征峰[11]，1 420 cm-1處出現的峰是酰胺Ⅲ帶吸收峰[15]。從圖中可見，降解前后殼聚糖的FTIR譜圖十分相似，不同分子量的殼聚糖的紅外吸收峰的位置一致，峰的相對強弱略微有所不同，但基本保持一致，這表明降解前后殼聚糖的化學結構沒有明顯改變，降解反應主要發生在糖單元間的β-(1, 4) 糖苷鍵的斷裂。

2.2 醋酸濃度對殼聚糖降解的影響

圖3 R與殼聚糖特性黏度[η]的關系圖

圖4 殼聚糖與α-淀粉酶質量比與殼聚糖特性粘度[η]的關系圖

2.3 H2O2用量對殼聚糖降解的影響

圖3為殼聚糖溶液的特性粘度隨溶液中H2O2用量變化的關系曲線，其中R(mL·g-1)為H2O2體積與殼聚糖質量之比。從圖中可見隨著H2O2用量的增加，特性粘度先減少后上升，在R為2.00～2.50范圍內溶液的特性粘度可以達到最低。這是因為在H2O2降解殼聚糖的過程中，H2O2在溶液中分解形成的HO2·、HO·以及(O)等游離基團的量會增加，如式(8)、(9)和(10)所示[6]。

H2O2→ H++ HOO-

(8)

HOO-→ OH-+ (O)

(9)

H2O2+HOO-→ HO· + O2-· + H2O

(10)

2.4 α-淀粉酶用量對殼聚糖降解的影響

圖4為殼聚糖在不同α-淀粉酶用量的溶液中降解后的特性粘度曲線。結果表明，隨著α-淀粉酶用量的增加，殼聚糖的特性粘度逐漸減少，這表明α-淀粉酶的加入對殼聚糖的降解有明顯的促進作用。2 %(V/V)醋酸溶液提供了殼聚糖降解的均相反應條件，而H2O2的存在又提供了氧化能力極強的HO·以及新生態的 (O)等游離基團，α-淀粉酶的加入，能夠進一步使殼聚糖的β-(1,4) 糖苷鍵水解，解決了單純使用H2O2容易導致褐變反應的問題，能明顯加快降解速度，同時使得到的殼聚糖產物保持更好的生物活性和更窄的平均分子量分布[5]。因此醋酸、H2O2和α-淀粉酶相互協同降解殼聚糖，降解效果明顯高于單一降解法。然而隨著殼聚糖的降解，當特性粘度下降到1.0時，m(殼聚糖):m(α-淀粉酶)=3.0，殼聚糖粘均分子量已經下降了95.48%，此時再加入更多的α-淀粉酶對殼聚糖降解的影響越來越小，同時考慮到成本因素，所以選擇適宜α-淀粉酶的用量為m(殼聚糖):m(α-淀粉酶)=3.0。

2.5 微波水熱時間對殼聚糖降解的影響

在上述確定的普通水熱法降解殼聚糖的適宜條件下，對殼聚糖降解的時間不同，根據公式 (1) 測得的樣品的脫乙酰度DD均在80 %左右，同時計算得出降解不同時間殼聚糖的粘均分子量如表1所列。由表1可見降解7 h后，殼聚糖分子量才從31 000 kDa下降到約1 400 kDa，降解速率比較慢。為提高降解效率，在上述優選出來的降解反應體系條件下，采用微波水熱法替代普通水熱法，仍然在40℃下對殼聚糖進行降解，不同時間下得到的殼聚糖粘均分子量如表2所示。

表1 不同普通水熱降解時間下的殼聚糖的粘均分子量

表2 不同微波水熱降解時間下殼聚糖的粘均分子量

由表2可見，采用微波水熱法降解殼聚糖，相比于普通水熱法，在相同的反應體系與溫度條件下，微波水熱降解40 min效果與傳統水熱9 h的降解效果相當，即殼聚糖粘均分子量下降99.8 %以上。微波水熱降解180 min后，殼聚糖粘均分子量從3.1×107Da 下降到2.4×104Da，大大提高了降解效率，縮短降解時間，并且降解后殼聚糖的脫乙酰度沒有明顯變化，均在80 %左右。

3 結論

使用微波水熱法，協同H2O2與α-淀粉酶在40℃下對殼聚糖進行降解，降解40 min的效果即與普通水熱法降解9 h的相當，降解時間大大縮短，有效提高了降解效率。FTIR光譜分析表明降解后的殼聚糖化學結構沒有明顯的改變，并且脫乙酰度也基本未變，是一種高效環保的殼聚糖降解方法，具有廣闊的應用前景。

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(責任編輯：呂海亮)

Microwave Hydrothermal Degradation of Chitosan

WU Taiheng, SHAO Qian, ZHAO Wenli

(College of Chemical and Environmental Engineering, Shandong University of Science and Technology, Qingdao, Shandong 266590, China)

A novel method of degradation of chitosan was investigated by using microwave hydrothermal method in the presence of H2O2and α-amylase with dilute acetic acid solution as solvent. The effects of the concentration of acetic acid, the dosage of H2O2and α-amylase, and the time of microwave hydrothermal on the degradation of chitosan were evaluated. And the structure of the degraded product was characterized by FTIR(Fourier Transform Infrared Spectroscopy). The results show that with the microwave hydrothermal method, the viscosity-average molecular weight of chitosan can decrease by more than 99.8% after 40 minutes’ reaction at 40℃ under the condition ofV(H2O2):m(chitosan)=2 mL/g andm(chitosan):m(α-amylase)=3, while it takes 9 hours to get the same degree of degradation with the traditional hydrothermal method. Therefore, the microwave hydrothermal method, which greatly improves the efficiency of the degradation of chitosan without changing the main macromolecular structure of chitosan, is a high efficient and environmentally friendly degradation method.

chitosan; microwave hydrothermal method; degradation; H2O2; α-amylase

2016-04-17

山東科技大學優秀教學團隊建設計劃項目(JXTD20160510)

武泰恒(1991—)，男，山東濟南人，碩士研究生，主要從事應用化學研究. 邵 謙(1964—)，女，浙江寧波人，教授，博士，主要從事應用化學研究， 本文通信作者. E-mail: shaoqian01@163.com

O636.1

A

1672-3767(2017)02-0081-06