食管鱗狀細胞癌高分辨率顯微內鏡圖像定量分析的診斷價值

賈逸文，屈亞威，劉海峰，

食管鱗狀細胞癌高分辨率顯微內鏡圖像定量分析的診斷價值

賈逸文1，屈亞威2，劉海峰1，2

目的 探究食管鱗狀細胞癌高分辨率顯微內鏡圖像定量分析的診斷價值。方法 選擇35例食管鱗狀細胞癌和正常食管黏膜的大體標本，在前期制定的食管鱗狀細胞癌高分辨率顯微內鏡(high resolution microendoscopy，HRME)診斷標準的基礎上，回顧性分析其HRME圖像特征。根據標本病理結果，由一名經驗豐富的HRME醫師挑選出1張HRME圖片，納入訓練集，用計算機軟件對圖像特征進行定量分析，制定圖像分析診斷標準。在此基礎上，將100例內鏡下疑診食管鱗狀細胞癌的活檢標本的HRME圖像納入測試集，進行HRME圖像定量分析，將計算機分析得出的預診斷結果與病理結果進行比較，評估定量分析HRME圖像對食管鱗狀細胞癌的診斷價值。結果 通過定量分析HRME圖像中細胞的核面積(nuclear area，NA)對食管鱗狀細胞癌和正常食管黏膜進行區分，經統計學分析，在訓練集中的敏感性和特異性分別為90%和97%，測試集中的敏感性和特異性分別為97%和90%。結論 定量分析HRME圖像可以區分食管鱗狀細胞癌組織和正常食管黏膜，并能夠增加診斷的客觀性，有利于HRME技術的推廣應用。

高分辨率顯微內鏡；食管癌；定量分析；診斷

食管癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其術后的5年生存率僅為19%[1]。而鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國最常見的病理類型。目前，國際上公認診斷食管癌的方法是盧戈碘染色后對食管不染色區域進行病理活檢[2]。這種方法雖然敏感性超過了95%，但是特異性低于65%[3，4]，很多食管表面的炎性病變常常也表現為不染或淡染區域，為了不造成漏診，臨床采取多部位活檢的方法，不僅增加了患者的費用，也延長了檢查時間，造成大量臨床資源的浪費[5-7]。近年來，隨著共聚焦顯微內鏡(confocal laser endomicroscopy，CLE)、高分辨率顯微內鏡(high-resolution microendoscopy，HRME)等亞細胞顯微成像技術的不斷出現[8-12]，能夠在內鏡檢查的同時，對病變區域實現類似于病理活檢的成像檢查，提高了食管癌的診斷效率，對改善預后具有十分重要的意義。

本課題組研發了一套HRME成像設備，在前期研究中，利用HRME技術已對食管鱗狀上皮炎性反應、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變、食管鱗狀細胞癌等標本進行成像，并總結出相關的診斷標準。雖然初學者通過學習診斷標準可以掌握HRME診斷技術[13，14]，但是不同的觀察者受到自身的主觀影響，對同一病變的HRME圖像診斷時存在差異，影響其診斷的準確性。然而，通過對HRME圖像進行計算機圖像處理并定量分析，不僅能夠增加HRME診斷的客觀性，同時減少了診斷時間[15-17]。本研究在之前制定的食管鱗狀細胞癌診斷標準的基礎上[18]，通過定量分析HRME圖像，從而評估這種方法對食管鱗狀細胞癌的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2015-05至2016-05就診于武警總醫院胸外科并行食管鱗狀細胞癌切除手術的大體標本35例，以及2015-05至2016-05就診于武警總醫院消化內鏡中心行內鏡檢查時疑診為食管鱗狀細胞癌的活檢標本100例。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 試劑與藥品 0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業股份有限公司)、0.01%原黃素鹽酸鹽(美國Sigma公司)、鏈霉蛋白酶顆粒(北京泰德制藥股份有限公司)、碳酸氫鈉(北京泰德制藥股份有限公司)等。

1.3 成像設備 自主研發的HRME成像系統，包括白光LED光源、500 nm二向色鏡、濾光片、1.8 m含30000像元的傳像光纖、10×顯微物鏡、三維組合平移臺、科學級低溫制冷CCD相機和計算機圖像處理軟件，成像過程中HRME以15幀/s的速度攝取圖像，由CCD傳輸至計算機。

1.4 方法

1.4.1 HRME檢查 在大體標本中，選擇腫瘤組織及切緣附近的正常食管表面黏膜組織的標本。對于內鏡下疑診為食管鱗狀細胞癌的患者，常規行組織活檢，選擇組織較完整、表面殘渣少的活檢標本。大體標本和活檢標本依次使用生理鹽水，去黏液劑(鏈霉蛋白酶顆粒和碳酸氫鈉混合溶液)和生理鹽水進行沖洗，去除表面黏液和殘留物，干棉球擦干，備用。將標本展平置于成像平臺上，局部噴灑0.01%原黃素鹽酸鹽2.0～3.0 ml，染色30 s后用生理鹽水洗去組織表面殘留染料，干棉球擦干組織表面的液體。光纖頭端以不同角度觀察組織表面，留取清晰的圖片用于圖像分析。

1.4.2 病理檢查 HRME成像后，進行點對點活檢，標本經甲醛溶液固定，行病理學檢查。

1.4.3 圖像質量 控制所有拍攝的HRME圖像由1名經驗豐富的HRME醫師根據病理結果進行圖片篩選，留取病理提示為食管鱗狀細胞癌和正常鱗狀上皮的HRME圖像。去除有運動偽影的、離焦的、有雜質覆蓋及病理診斷為其他的HRME圖像，從剩余圖像中選取一張能最能體現病變特征的清晰HRME圖像。所有大體標本攝得的HRME圖像納入訓練集，所有活檢標本攝得的圖像納入測試集。

1.4.4 圖像分析 在訓練集中，分別提取食管鱗狀細胞癌組和正常鱗狀上皮HRME圖像特征進行分析。首先在圖像中去除過暗和過亮的區域，這些區域是由于成像光纖頭端不平整或染料聚集造成的。通過對圖像進行低通濾波處理，使用閾值標記出過暗或過亮的區域，將這些區域去除，留下亮度均勻的區域中，選取500×500像素大小區域作為可疑病灶區域(region of interest，ROI)進行圖像分析。對ROI區域進行高斯濾波處理，去除圖像中的網格，這些網格是光纖束的輪廓，在成像時不可避免，會影響圖像質量。形態學圖像處理標記并分割出ROI中的細胞核。使用直方圖二值化的算法，確定細胞核的閾值，可以將ROI中的細胞核和核外胞質進行分割，并計算細胞核面積。整個圖像分析過程耗時2.5 s(圖1)。

1.4.5 圖像分類 分別計算在訓練集中食管鱗狀細胞癌和正常鱗狀上皮HRME圖像ROI中的核面積大小，尋找區分病變的最適值。將此值帶入測試集加以驗證，以病理學為金標準，評估定量分析HRME圖像對食管鱗狀細胞癌的診斷價值。

1.5 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析。分別計算在訓練集、測試集中定量分析HRME圖像對食管鱗狀細胞癌診斷的敏感性、特異性，繪制ROC曲線，計算AUC面積。

圖1 高分辨率顯微內鏡圖像診斷食管鱗狀細胞癌圖像定量分析流程

A，F.選取可疑病灶區域；B，G.光纖輪廓形成圖像中的網格；C，H.使用高斯濾波去除圖像網格；D，I.直方圖二值化分割細胞核；E，J.計算細胞核面積

2 結 果

2.1 一般情況 在35例大體標本中，包括潰瘍型9例，腫塊型19例和縮窄型7例，病理檢查后，診斷為中-高分化鱗癌10例，中分化鱗癌15例和中-低分化鱗癌9例，HRME成像的正常食道黏膜經病理檢查后均證實為正常鱗狀上皮組織。100例活檢標本中，病理檢查后，診斷為正常組織58例，食管鱗狀細胞癌20例，其他22例。

2.2 HRME 圖片選擇35例大體標本共獲得756張圖片，經篩查后留取60張圖片并納入訓練集用于圖像分析，制定最適細胞核面積。100例活檢標本共獲得1283張圖片，經篩查后，留取78張圖片納入測試集用于圖像分析，評估最適細胞核面積的診斷效果。135例拍攝位點及病理結果見表1。

表1 135例HRME拍攝位點病理結果 (n)

2.3 定量圖像分析效果 在訓練集中，所用圖像將按照圖像分析步驟被定量分析，計算細胞核面積并記錄。在正常鱗狀上皮細胞圖像中，細胞排列規則，細胞核圓，大小均一，核間距正常，視野內的細胞形態基本一致；鱗狀細胞癌圖像中，細胞排列紊亂，細胞核大小不一，形態各異，排列及其紊亂，核間距減小，同時出現了大量的細胞核疊加。經計算ROI區域中的細胞核面積，正常鱗狀上皮細胞的平均核面積為(157.32±60.67)μm2，而鱗狀細胞癌的平均核面積為(583.40±146.40)μm2，兩組細胞核面積差異具有統計學意義(P<0.01)。

訓練集中正常鱗狀上皮及食管鱗狀細胞癌細胞的核面積散點圖，并用虛線表示出可以區別兩種結構的最適核面積，最適核面積為381.25 μm2。將此處作為診斷指標，敏感性和特異性分別為90%和97%(圖2A)。在測試集中應用得到的最適核面積進行驗證，診斷正常鱗狀上皮與食管鱗狀細胞癌細胞的敏感性和特異性分別為97%和90%(圖2B)。訓練集和測試集的受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)中，ROC曲線下面積(area under curve，AUC)分別為0.99和0.98(圖3)。

圖2 高分辨率顯微內鏡拍攝位點的分布

圖3 圖像定量分析診斷效果

A.訓練集，應用最適核面積診斷食管鱗狀細胞癌敏感性和特異性分別為90%和97%；B.測試集，最適核面積診斷食管鱗狀細胞癌敏感性和特異性分別為90%和97%；AUC為曲線下的面積

3 討 論

HRME作為一種新型的內鏡檢查手段，可以對組織的亞細胞結構進行顯微觀察，具有廣闊的應用前景[19-21]。本課題組前期研究證明，通過判讀HRME檢查圖像可以診斷食管鱗狀細胞癌，敏感性為96%，特異性為 86%[18]。作為一種新技術，熟練掌握并運用其診斷疾病，需要一定的學習時間[22]。由于不同學習者自身的素質不同，對病變的主觀判斷也存在差異[23]，而這種差異往往會影響診斷結果，造成漏診誤診。通過定量分析HRME圖像，可以提取其特征值，采用比較特征值的差異來診斷疾病，減少了人為因素的干擾，增加HRME診斷的客觀性，從而提升了診斷準確性[24]。

本研究評估了定量分析HRME圖像診斷食管鱗狀細胞癌的可行性，證明通過計算并比較HRME圖像中細胞核面積，可以區分食管正常鱗狀上皮和食管鱗狀細胞癌。這種診斷方法在訓練集中其敏感性為90%，特異性為97%，測試集中敏感性為97%，特異性為90%。相比之前通過人為判讀HRME圖像的診斷方法，不僅具有極高的敏感性和特異性，還避免了不同HRME醫師的主觀因素對診斷結果的干擾，增加了診斷的準確性。同時，計算機可以根據HRME圖像自主進行預診斷，極大的減少了HRME醫師的工作壓力，方便非專業HRME醫師使用，有助于HRME技術的推廣。

食管鱗狀上皮細胞內含有大量糖原，遇碘后發生化學顯色反應呈棕褐色，而食管癌及癌前病變的細胞內糖原含量減少，遇碘不著色，形成不染區域。所以，目前臨床上廣泛使用的盧戈碘對食管可疑病變進行染色的方法來發現食管癌及癌前病變。碘染后能夠清晰顯示食管病變黏膜的范圍及形態，在不染區域進行活檢，能夠提高活檢的準確性及早期食管癌的檢出率，據文獻[3，4]報道，其診斷食管癌的敏感性超過95%，特異性低于65%。這種方法雖然對病變有極高的敏感性，但特異性并不高，加之活檢具有的隨意性，且病變分化程度具有不均一性，臨床使用中往往因為不能準確活檢到食管癌細胞，而造成漏診。

與盧戈式碘染色活檢法一樣，HRME技術同樣建立在檢查者主觀疑診的基礎上，所以仍然存在漏診的情況。但如能將HRME技術與盧戈式碘染色活檢相結合，利用盧戈碘染色的高敏感性發現病變，并在盧戈碘染色的基礎上，對不染區域進行HRME檢查，后再取活檢可以彌補單純碘染色特異性低的不足。能夠從根本上提升活檢的準確性。對于臨床診斷食管鱗狀細胞癌具有重要意義。

本研究結果表明，通過定量分析HRME圖像對診斷食管鱗狀細胞癌具有重要意義，但此研究仍有一些局限性：(1)本研究為單中心實驗，未做多中心驗證；(2)受到自動圖像幀選和算法處理時間的限制，圖像定量分析還未能做到實時分析。下一步準備在圖像識別方面做新的研究。

綜上所述，盡管該技術還未能達到理想的效果，但本實驗展示了定量分析HRME圖像對食管鱗狀細胞癌具有較高的診斷價值，如能與當前染色活檢法相輔相成，可以提高活檢的準確性，并減少不必要的活檢操作。同時，圖像定量分析也有利于HRME技術的推廣。未來實現在體實時的HRME圖像定量分析，可對病變邊界進行判斷，這將有利于在治療中減少病變的切除范圍，從而減少治療操作對患者造成的醫療創傷[25]。隨著HRME技術的相關研究越來越多，這項新的技術也必將體現更好的診斷價值。

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(2016-10-17收稿 2016-12-06修回)

(責任編輯 武建虎)

Quantitative analysis of high resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma

JIA Yiwen1，QU Yawei2，and LIU Haifeng1，2.

1.Graduate School, Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 2.Department of Gastroenterology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force，Beijing 100039，China

Objective To explore the diagnostic value of high-resolution microendoscopy in quantitative analysis of esophageal squamous cell carcinoma.Methods Thirty-five cases of esophageal squamous cell carcinoma and normal esophageal mucosa were selected. The HRME image of esophageal squamous cell carcinoma was analyzed retrospectively. According to the pathological results of specimens, an HRME image was selected by an experienced HRME clinician to be included in the training set. The image features were quantitatively analyzed by computer software, and diagnostic criteria for image analysis were formulated. On this basis,the HRME images of biopsy specimens of 100 cases of suspected esophageal squamous cell carcinoma were input into the test set for quantitative analysis of these HRME images. The results of pre-diagnosis via a computer were compared with pathological results. The diagnostic value of quantitative HRME images for esophageal squamous cell carcinoma was determined.Results The quantitative analysis of the nuclear area in HRME images was used to distinguish esophageal squamous cell carcinoma from normal esophageal mucosa. Statistical analysis showed that the sensitivity and specificity were 90% and 97% respectively in the training set, but were 97% and 90% respectively in the test set.Conclusions Quantitative analysis of HRME images can distinguish esophageal squamous cell carcinoma from normal esophageal mucosa, increase the reliability of diagnosis, and contribute to the popularization and application of this technology.

high resolution microendoscopy；esophageal squamous cell carcinoma；quantitative analysis；diagnostic

首都臨床特色應用研究(Z141107002514099)

賈逸文，碩士研究生。

1.230032 合肥，安徽醫科大學研究生院;

2.100039 北京，武警總醫院消化內科

劉海峰，E-mail：haifengliu333@163.com

R604；R735.1