Caspase-3對5-ALA誘導鱗狀細胞癌Colo-16細胞凋亡效應的影響

徐 勁,喬 麗,楊志勇,劉 瑋

Caspase-3對5-ALA誘導鱗狀細胞癌Colo-16細胞凋亡效應的影響

徐 勁,喬 麗,楊志勇,劉 瑋

目的 探討半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)對光敏劑5-氨基酮戊酸(5-ALA)誘導鱗狀細胞癌Colo-16細胞凋亡效應的影響。方法 取對數生長期的Colo-16細胞用于實驗，將細胞分為對照組、5-ALA-光動力療法(photodynamic therapy,PDT)組和Caspase-3抑制劑組(Z-DEVD-FMK)，對照組不給予光敏劑和照光處理，5-ALA-PDT組給予0.4 mg/ml的5-ALA避光孵育4 h后，采用(功率密度10 mW/cm2，能量密度2.5 J/cm2)激光照射3 min，之后繼續培養12 h。Caspase-3抑制劑組除孵育時同時加入Z-DEVD-FMK(終濃度40 μmol)，其余處理與5-ALA-PDT組相同。實驗后收集各組細胞，通過免疫熒光觀察各組細胞胞內Caspase-3熒光強度的變化，通過流式細胞術檢測活性Caspase-3陽性細胞百分率和細胞凋亡率。結果 免疫熒光結果發現對照組和Caspase-3抑制劑組Colo-16細胞胞漿中有微弱綠色熒光，表明Caspase-3表達量低，而5-ALA-PDT組中綠色熒光顯著增強，表明其胞漿內Caspase-3含量顯著增高。流式細胞儀的檢測結果顯示，對照組、5-ALA-PDT組和Caspase-3抑制劑組active-Caspase-3陽性細胞百分率分別為(2.26±0.16)%、(32.16±1.31)%和(3.36±0.31)%，5-ALA-PDT組高于對照組和Caspase-3抑制劑組，差異有統計學差異(P<0.05)。對照組、5-ALA-PDT組和Caspase-3抑制劑組的凋亡率分別為(2.35±0.22)%、(31.55±3.68)%和(11.46±2.25)%，三組之間兩兩比較，差異都有統計學意義(P<0.01)。結論 5-ALA-PDT可以誘導Colo-16細胞發生凋亡，且這種效應與caspase-3的激活密切相關。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；鱗狀細胞癌；Colo-16細胞；5-氨基酮戊酸；細胞凋亡

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種治療腫瘤的新方法，在多種惡性腫瘤的臨床實驗研究中取得了滿意的療效[1]。目前研究表明，PDT誘導腫瘤細胞凋亡是其發揮抗腫瘤療效的重要機制之一。細胞中主要存在兩條凋亡信號轉導通路，即死亡受體通路和線粒體通路，而這兩條通路激活后最終均需要經過Caspase-3來執行凋亡效應，因此Caspase-3是凋亡通路中的關鍵效應蛋白[2-6]。基于上述研究進展，本研究假設Colo-16細胞在經過5-ALA-PDT照射后可導致Caspase-3的活化從而引起腫瘤細胞凋亡，進一步探討5-ALA-PDT 誘導Colo-16細胞凋亡的分子機制打下基礎，并為臨床5-ALA-PDT治療皮膚鱗狀細胞癌提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器 Colo-16細胞，南京皮膚病研究所惠贈。主要試劑5-ALA(購于Sigma公司)；Caspase-3mAb (美國RD公司)；DMEM高糖培養液(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；細胞周期試劑盒(美國BD公司)；630 nm半導體紅光激光器(桂林興達光電醫療器械有限公司)；LM-93II型激光功率計(中國電子計量院)；Olympus-BH2型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞的培養及傳代 細胞培養：Colo-16細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養液，溫度37 ℃，5%CO2條件下培養，取對數生長期細胞用于實驗。細胞傳代：待細胞80%～90%融合時，用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液。按1∶2比例傳代培養。

1.3 實驗分組與處理 實驗分為對照組、5-ALA-PDT組和 Caspase-3抑制劑組。對照組不給予光敏劑和照光處理，5-ALA-PDT組給予0.4 mg/ml的5-ALA避光孵育4 h后，用激光照射3 min(功率密度10 mW/cm2，能量密度2.5 J/cm2)，照光前后均監測輸出功率，輸出功率波動范圍±5%，之后繼續培養12 h。Caspase-3抑制劑組除孵育時同時加入Z-DEVD-FMK(終濃度40 μmol)，其余處理與5-ALA-PDT組相同。實驗處理后收集細胞，進行下一步的檢測，每組實驗重復5次。

1.4 Caspase-3熒光染色及觀察 將滅菌后的蓋玻片經多聚賴氨酸包被后置于6孔板中，加入一定量的細胞懸液，培養過夜待細胞完全貼壁后進行實驗。實驗后傾去培養液并用PBS洗滌，依次用4%濃度的多聚甲醛中處理20 min，用0.1% Triton x-100將細胞固定6 min。之后用PBS洗滌，并加入適量的Caspase-3單克隆抗體(santa Cat# sc-271759；1∶100稀釋)4 ℃孵育24 h。再用PBS洗滌并加入FITC-綴合山羊抗鼠免疫球蛋白(中杉金橋 ZF-0312；1∶1000稀釋)室溫孵育40 min。加入PI(150 mmol/L)并在熒光顯微鏡下觀察Caspase-3的熒光強度。

1.5 流式細胞技術檢測active-Caspase-3的表達 染色方法和檢測方法參照試劑盒的說明書進行。收集各組細胞，離心后用PBS洗滌各組細胞2次，再次離心后用Binding Buffer制成總數為1×105細胞/毫升的重懸液。用Cytofix/CytopermTM(BD公司,美國)破細胞膜后加入Caspase-3 mAb(1∶50)，室溫下避光孵育2 h；用PBS洗滌3次后加入用FITC標記的二抗(1∶100)，室溫避光孵育30 min，流式細胞儀檢測分析。每標本計數105個細胞，每組實驗重復5次。FITC的EM波長為525 nm，EX波長為488 nm。

1.6 PI染色法檢測Colo-16細胞的凋亡率 染色及檢測方法按照試劑盒的說明書進行。分別收集各組細胞，經胰酶消化后用PBS制成單細胞懸液，乙醇4 ℃固定過夜。上機檢測前用PBS洗去乙醇后離心，再用PBS(RNaseA 0.1 μg/ml和PI 40 μg/ml)重新懸浮細胞，37 ℃避光孵育15 min，最后經流式細胞儀檢測及分析。每組實驗重復5次。PI的EM為633 nm，EX波長為488 nm。

2 結 果

2.1 5-ALA-PDT誘導鱗狀細胞癌Colo-16細胞凋亡中Caspase-3表達的變化 經FITC-Caspase-3和PI染色后在熒光顯微鏡下觀察到，各組Colo-16細胞爬片上都有散在的細胞核結構，核大圓形或橢圓形，染色呈紅色。對照組可以觀察到雙核細胞，表明該組細胞仍然處于分裂增殖階段。對照組和Caspase-3抑制劑組Colo-16細胞的細胞漿中有微弱綠色熒光，表明Caspase-3表達量低，5-ALA-PDT組中綠色熒光顯著增強，表明其胞漿內Caspase-3含量增高(圖1)。流式細胞儀的檢測結果顯示，對照組、5-ALA-PDT組和Caspase-3抑制劑組active-Caspase-3陽性細胞百分率分別是(2.26±0.16)%、(32.16±1.31)%和(3.36±0.31)%，5-ALA-PDT組高于對照組和Caspase-3抑制劑組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 抑制 Caspase-3活化對5-ALA誘導鱗狀細胞癌Colo-16細胞凋亡的影響 對照組、5-ALA-PDT組和Caspase-3抑制劑組的凋亡率分別為(2.35±0.22)%、(31.55±3.68)%和(11.46±2.25)%，3組之間兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。

圖1 免疫熒光觀察5-ALA-PDT 處理后胞漿中

3 討 論

隨著激光系統和光敏劑的不斷發展，光動力日益成為治療腫瘤的新方法，被廣泛應用于臨床中。光動力已經被用于皮膚鱗狀細胞癌的治療性和姑息性處理，也常應用于一些較大區域而且淺層或有多種腫瘤同時存在的皮膚癌的治療。PDT處理后的病變區域外觀好，不遺留瘢痕，避免了外科手術瘢痕給患者造成的精神痛苦。光動力導致腫瘤細胞的凋亡主要體現在3個方面：(1)腫瘤細胞的直接殺傷作用；(2)通過作用于腫瘤組織的微血管造成血管完全封閉，使腫瘤組織缺氧，從而導致腫瘤組織壞死；(3)調節免疫的作用。腫瘤細胞經過PDT作用后主要以凋亡或壞死為主。光動力能引起細胞以凋亡、壞死和自噬三種不同形式死亡，其對腫瘤的治療作用主要是通過誘導腫瘤細胞凋亡而產生的[4,7]。Caspase-3起執行細胞凋亡、剪切凋亡底物作用，是最重要的凋亡執行因子。因此，探索Caspase-3在光動力治療腫瘤中的變化規律及其生物學作用具有重要作用。

本研究結果表明，PDT治療后Colo-16細胞凋亡率顯著上升，同時胞內Caspase-3的表達量也顯著上升。而采用Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK后可顯著抑制PDT誘導的胞內Caspase-3的表達，并緩解PDT治療誘導的細胞凋亡。此外，盡管Z-DEVD-FMK可以特異性抑制Caspase-3的活性，但該組細胞經5-ALA-PDT作用后凋亡率仍明顯高于對照組，表明5-ALA-PDT誘導COLO-16細胞發生凋亡效應并不僅僅依賴于Caspase-3的激活，可能還與信號傳導途徑的激活或其他因子的釋放有關。由于PDT誘導腫瘤細胞凋亡是一個多因素參與的復雜反應體系[8-11]，還需要進一步研究和完善凋亡的各種機制。

綜上所述，本研究檢測了在5-ALA-PDT誘導COLO-16細胞發生死亡效應時Caspase-3的表達及活化情況，并探討了其與COLO-16細胞凋亡的關系。結果表明在5-ALA-PDT治療后，COLO-16細胞中活化的caspase-3顯著增加，從而導致了腫瘤細胞的凋亡。下一步，還將深入研究5-ALA-PDT誘導的腫瘤細胞凋亡的機制，從而為臨床上廣泛應用5-ALA-PDT治療皮膚鱗狀細胞癌提供了理論依據。

[1] 劉慧龍，劉端祺，介雅慧，等. 激光光動力療法治療皮膚惡性腫瘤的臨床研究[J]. 解放軍醫學雜志，2007，32(4): 396-397.

[2] Dolmans D E，Fukumura D，Jain R K. Photodynamic therapy for cancer[J]. Nat Rev Cancer，2003,3(5):380-387.

[3] Buytaert E，Dewaele M，Agostinis P. Molecular effectors of multiple cell death pathways initiated by photodynamic therapy [J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1776(1): 86-107.

[4] Garg A D，Nowis D，Golab J，etal. Photodynamic therapy: illuminating the road from cell death towards anti-tumour immunity [J]. Apoptosis, 2010, 15(9): 1050-1071.

[5] Kim K H, Park J J. The effects of photodynamic therapy in upper-gastrointestinal malignant diseases [J]. Gut Liver, 2010, 4(Suppl1): S39-S43.

[6] Tirapelli L F, Morgueti M, Cunha Tirapelli D P,etal. Apoptosis in glioma cells treated with PDT [J]. Photomed Laser Surg, 2011, 29(5): 305-309.

[7] Castano A P, Demidova T N, Hamblin M R. Mechanisms in photodynamic therapy: part one-photo sensitizers, photochemistry and cellular localization [J]. Photodiagn Photodyn, 2004, 1(4): 279-293.

[8] Yang L, Wei Y, Xing D,etal. Increasing the efficiency of photodynamic therapy by improved light delivery and oxygen supply using an anticoagulant in a solid tumor model [J]. Lasers Surg Med,2010,42(7):671-679.

[9] Weiss A, den Bergh H V, Griffioen A W,etal. Angiogenesis inhibition for the improvement of photodynamic therapy: The revival of a promising idea [J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1826(1): 53-70.

[10] Kessel D, Oleinick N L. Initiation of autophagy by photodynamic therapy [J]. Methods Enzymol, 2009, 453: 1-16.

[11] Ji H T, Chien L T, Lin Y H,etal. 5-ALA mediated photodynamic therapy induces autophagic cell death via AMP-activated protein kinase [J]. Mol Cancer, 2010, 9(4): 91-101.

(2016-10-20收稿 2016-12-10修回)

(責任編輯 武建虎)

Effects of caspase 3 on apoptosis of squamous-cell carcinoma Colo-16 cells induced by 5-ALA-PDT

XU Jin, QIAO Li, YANG Zhiyong, and LIU Wei.

Department of Dermatology, General Hospital of Air Force, Beijing 100142, China

Objective To investigate the role of caspase-3 in the apoptosis of squamous-cell carcinoma Colo-16 cells induced by 5-ALA-PDT.Methods Colo-16 cells in the logarithmic growth phase were divided into three groups: control group, 5-ALA photodynamic therapy (PDT) group, and caspase-3 inhibitor group (Z-DEVD-FMK). Control group was not given photosensitizer or light treatment. 5-ALA PDT group was exposed to 3-minute laser irradiation at a power density of 10 mW/cm2 and energy density of 2.5 J/cm2 after 4 hours of dark incubation with 0.4 mg/ml 5-ALA before being cultured for 12 hours. Caspase3 inhibitor group was treated in the same way as 5-ALA PDT group except that Z-DEVD-FMK at a final concentration of 40 μmol was added during incubation. Cells in each group were collected after experiment, the changes of intracellular caspase-3 fluorescence intensity were observed by immunofluorescence, and the percentage of positive cells and apoptosis rate of active caspase-3 were detected by flow cytometry.Results Immunofluorescence results showed that there was weak green fluorescence in the cytoplasm of Colo-16 cells in control group and Caspase-3 inhibitor group, indicating a low expression of caspase-3, while green fluorescence was significantly enhanced in 5-ALA-PDT group, showing a significant increase of caspase-3 content in cytoplasm of Colo-16 cells. Flow cytometry results showed that the respective percentage of active caspase-3 positive cells was (2.26±0.16)%,(32.16±1.31)% and (3.36±0.31)% in control group, 5-ALA PDT group and caspase-3 inhibitor group respectively. The difference was statistically significant (P<0.05). The apoptosis rate of control group, 5-ALA PDT group and caspase-3 inhibitor group was (2.35±0.22)%,(31.55±3.68)% and (11.46±2.25)%, respectively. Paired comparison was made between the three groups, and the differences were statistically significant (P<0.01).Conclusions The apoptosis of Colo-16 cells induced by 5-ALA-PDT is closely related to the activation of caspase-3.

caspase-3; human cutaneous carcinoma cell line；Colo-16; 5-ALA-PDT; apoptosis

徐 勁, 碩士，主治醫師。

100142 北京，空軍總醫院皮膚科

喬 麗，E-mail：winhp2006@163.com

R739.5; R730.57