肺腺癌化療療效相關血漿差異蛋白質組學研究

朱敬華 王曉華 王富強

肺腺癌化療療效相關血漿差異蛋白質組學研究

朱敬華 王曉華 王富強

目的 分析晚期肺腺癌患者培美曲塞聯合順鉑方案化療進展組和非進展組的血漿差異蛋白質組，篩選肺腺癌化療療效相關的分子標志物。方法 將4例進展組和4例非進展組治療前和治療后的血漿分別進行二維電泳，凝膠蛋白圖譜尋找差異蛋白質點，結合基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜鑒定差異蛋白質點。結果 建立了兩組的二維凝膠電泳圖譜，選取其中21個差異蛋白點進行分析，19個蛋白點鑒定成功，包括如丙酮酸激酶M2、腺苷酸激酶5、a-2抗纖維蛋白溶酶的前體，r纖維蛋白、氧化固醇結合蛋白相關蛋白3等。結論 肺腺癌不同化療療效患者的血漿差異蛋白可能為化療療效預測的生物標志物。

肺腺癌；化學治療；腫瘤標志物；蛋白質組學

肺癌是我國最常見腫瘤，也是致死率最高的腫瘤。分為小細胞肺癌(約占15%)和非小細胞肺癌(約占85%)，后者包括腺癌，鱗癌，大細胞癌等，其中腺癌最為常見，并呈逐漸上升趨勢。對于表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因野生型或基因狀態不明確者，首選以培美曲塞聯合鉑類的化療[1-2]。國內該方案有效率達36-47%[3]，仍有部分患者無效，并出現較為嚴重的毒副反應。臨床腫瘤標志物的檢測，對肺癌的早期診斷、病理分型、臨床分期、預后及療效評估具有重要應用價值[4-5]。目前已有通過檢測組織標本中胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)[6]、切除修復交叉互補基因1(excision repair cross-complementing 1, ERCC-1)[7]等來預測該方案的有效性。本研究的目的是在易獲得的血液中尋找蛋白標志物來預測化療反應。

資料與方法

一、 診斷與療效判定標準

參照UICC 2010年版進行TNM分期。按照RECIST1.1版本進行療效判定。分為完全緩解(complete remission，CR)、部分緩解(partial remission，PR)、疾病穩定(stable disease，SD)和疾病進展(progressive disease，PD)。緩解和穩定患者2周期化療后一月再復查，進行療效確認。按照以上療效判定標準，分為進展組(progression group, P組)，包括PD患者；非進展組(non-progression group, NP組)也即臨床獲益組，包括CR+PR+SD。

二、 研究對象

采取初治Ⅳ期肺腺癌患者行培美曲塞聯合順鉑化療前后的血漿。2011年2月至2012年3月8例患者入組，均為EGFR野生型或基因狀態不明確者，化療用培美曲塞500mg/m2，順鉑60-75mg/m2分為1或3天使用。8例患者既往均無特殊病史，否認吸煙史。8例患者中4例為化療后進展者，男性2例，年齡47-55歲，平均年齡51歲；4例為化療后非進展患者，并在2周期化療后一月確認療效，男性2例，年齡41-56歲，平均年齡50歲。8例入組患者ECOG評分均≤1分。

三、研究方法

1 血清中高豐度蛋白的去除：按Agilent公司multiple affinity removal spin cartidge說明書操作。收集過濾液，再按GE公司2-d clean-up kit的說明書操作脫去干擾雙向電泳物質。最終的過濾液-20℃保存。

2 雙向凝膠電泳：選用IPG膠條(24cm，pH 3-10，NL)。8 0ug總蛋白與水化液(7 molfL Urea，2%CHAPS，18 mmol/L DTr，0．5%IPG Buffer，0.002%Bromophenolblue)混勻，上樣總體積為450μL。在IPGphor等電聚焦系統進行第一向電泳。在Ettan DALT II平板電泳系統上行第2向凝膠電泳。

3 二維凝膠蛋白圖譜的分析：通過ImageScanner掃描儀以及Labscan掃描軟件將染色后的凝膠進行掃描獲取圖像。利用Image MasterTM 2D Platinum software (Version 5．0)軟件對凝膠圖像進行分組、強度校正、蛋白點檢測、點配對。對于2組比較有意義的蛋白點，行MALDI-TOF-MS鑒定分析。

4 膠內酶解及MALDI-TOF/TOF-MS分析：將感興趣的差異點從膠上切下，反復沖洗，25 mmol/L NH4HCO3、ACN脫水，加入20 ng胰酶，在NH4HCO3中37℃水浴，過夜，加入TFA至終質量濃度為0.1%，終止酶解反應。樣品1 μL點于靶上，干燥后再點1 μL樣品，充分干燥后點少許基質(a-HCCA)置于Ultraflex II MALDI-TOF/TOF質譜儀上操作分析。獲取肽質量指紋圖譜

5 數據庫查詢：將獲得的肽片段質量指紋圖譜，用Flexanalysis 3.0軟件處理，胰蛋白酶的自解片段作為內標校準。Mascot搜索引擎(http：//www.matrixscience.com)在Swiss Prot數據庫進行查詢。綜合評估其相對分子質量和等電點的匹配程度，確定蛋白名稱。

結 果

一、 雙向凝膠電泳結果

進展組和非進展組比較，74個蛋白點變化有統計學意義。進展組治療前和治療后比較，41個蛋白點變化有統計學意義，其中12個蛋白點治療后表達上升。非進展組治療前和治療后比較，38個蛋白點變化有統計學意義，其中12個蛋白點治療后表達下降。按照進展組和非進展組之間表達有差異，結合化療前后表達變化情況，選取其中21個蛋白點進行進一步分析。

二、質譜結果及生物信息學分析

將選取的21個差異蛋白點進行分析，19個蛋白點鑒定成功。匹配分數在78分以上。鑒定結果(見表1)。其中進展組高表達14個，包括：Adenylate kinase 5，hp2-alpha，alpha-2-antiplasmin precursor，fibrinogen gamma，Pyruvate Kinase M2等。進展組低表達5個，包括：Retinol-Binding Protein，HIC-3，Transferrin Binding Protein B等。分析這些差異蛋白質，發現它們與代謝活動、物質轉運或凝血功能相關。另外，在化療前后，一部分蛋白質的表達發生改變，部分升高，部分降低。

討 論

化療療效的預測是腫瘤研究的一個重要方向。在肺癌化療前，針對組織樣本中TS、ERCC-1等來預測培美曲塞聯合鉑類治療的有效性。但組織樣本常由于活檢樣本量少，或有時取得的是細胞樣本，無法滿足進一步檢測的要求。而如果能在血液中尋找到與化療療效相關的標志物，即可為臨床提供便捷、創傷小而有效的方法。蛋白是基因功能的最終執行者，蛋白質組學技術是研究蛋白質的重要方法。比較蛋白質組學技術，可通過比較腫瘤組織與正常組織蛋白表達不同[8]，或比較腫瘤患者血液與正常人血液蛋白質表達不同[9]，尋找與腫瘤相關的標志物，便于腫瘤的診斷；也可通過比較對化療藥物敏感性不同找到化療療效相關標志物[10-12]。血液中通過蛋白質組學的方法，找到相關化療療效標志物，對臨床有著重要意義。

既往文獻報道肺腺癌患者化療敏感性的血清蛋白質組學研究，化療方案常為鉑類聯合其它各種化療藥物[10-11]，本研究中入選的肺腺癌患者均使用同一培美曲塞聯合順鉑化療，排除了其它化療藥物的干擾。另外，根據化療療效不同的分組中，文獻報道通常分為有效組(CR+PR)組和無效組(SD+PD)。本研究分進展組(耐藥組，PD患者)和非進展組(CR+PR，包括SD的患者)，因為達SD患者臨床也能獲益，無需更改化療方案。這種分組方法與臨床實踐中情況更為一致。

表1 肺腺癌不同療效患者血漿中的差異蛋白

本研究組中病例數較少，但所有患者均為Ⅳ期肺腺癌，進展組和非進展組患者性別、年齡、一般狀況平衡。既往研究發現，高血壓、糖尿病等疾病對患者的蛋白質組學結果有影響[13-14]，甚至吸煙狀況都會改變蛋白質組研究結果[15]。為排除這些干擾，本研究選擇的入組患者均為無既往特殊病史，無吸煙史者，以確保結果的可靠性。

另外，本研究為排除個體差異的影響，結合了化療前后患者血漿蛋白質組學的對比，結果共篩選出21個差異蛋白點， 19個蛋白點鑒定成功。丙酮酸激酶M2、r纖維蛋白等14個蛋白在耐藥組中呈高表達，其中丙酮酸激酶M2、r纖維蛋白等8個蛋白在化療后表達升高；而轉鐵蛋白結合蛋白B、HIC-3等5個蛋白在耐藥組中呈低表達，其中HIC-3在化療后表達升高。研究發現這些蛋白質一部分與代謝活動相關，如丙酮酸激酶M2、腺苷酸激酶5等；一部分與凝血有關，如α-2抗纖維蛋白溶酶的前體，r纖維蛋白；一部分與脂代謝相關，如載脂蛋白A-I；還有部分與物質轉運有關，如視黃醇結合蛋白、氧化固醇結合蛋白相關蛋白3等。提示化療耐藥患者中代謝功能增強，凝血功能激活。另外，治療對患者血清蛋白質圖譜也有顯著的影響[16]，患者放化療前后血清蛋白質圖譜也發生了明顯的變化[17]。本研究中部分血漿蛋白質在化療后表達也有改變，表現為升高或下降。

本研究中通過不同化療療效的蛋白質組學分析，初步尋找到預測化療療效的相關蛋白質，為進一步尋找預測化療療效的差異蛋白質組學研究提供了樣本。但因為病例數相對較少，研究結果可能會出現較大的異質性，需擴大病例數進行進一步研究。

[1] Lee JK, Hahn S, Kim DW, et al. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitorsvsconventional chemotherapy in non-small cell lung cancer harboring wild-type epidermal growth factor receptor: a meta-analysis[J]. JAMA,2014,311(14):1430-1437.

[2] Scagliotti G, Brodowicz T, Shepherd FA, et al. Treatment-by-histology interaction analyses in three phase III trials show superiority of pemetrexed in nonsquamous non-small cell lung cancer[J]. J Thorac Oncol,2011,6(1):64-70.

[3] 陳文怡,王韡旻,姜麗巖,等. 培美曲塞聯合鉑類一線治療晚期非鱗非小細胞肺癌的臨床觀察[J]. 中國癌癥雜志, 2014,24(8):610-614.

[4] 夏彥東,常延河,楊宏秀, 等.HPA和MMP9對非小細胞肺癌患者臨床預后評價的意義研究[J].臨床肺科雜志,2015,20(12):2148-2152.

[5] 王溪清,劉東華. 肺癌腫瘤標志物新進展[J]. 臨床肺科雜志,2015,20(5):921-926.

[6] Nicolson MC, Fennell DA, Ferry D, et al.Thymidylate synthase expression and outcome of patients receiving pemetrexed for advanced nonsquamous non-small-cell lung cancer in a prospective blinded assessment phase II clinical trial[J]. J Thorac Oncol,2013,8(7):930-939.

[7] Cobo M, Isla D, Massuti B, et al.Customizing cisplatin based on quantitative excision repair cross-complementing 1 mRNA expression: a phase III trial in non-small-cell lung cancer[J]. J Clin Oncol,2007, 25(19):2747-2754.

[8] 蔣敏,顧國浩,王文靜,等. 肺癌組織與癌旁組織的差異蛋白譜[J]. 廣東醫學,2015, 36(17):2710-2713.

[9] 王冬濱,張遜,韓洪利,等. 應用蛋白質組學技術篩選I期非小細胞肺癌的差異表達蛋白[J]. 中華實驗外科雜志,2012,29(8):1472-1474.

[10] 趙健,徐維,王遠東,等.應用蛋白芯片技術篩選肺腺癌化療敏感血清蛋白標志物[J]. 實用腫瘤學雜志,2010,24(1):20-23.

[11] 傅文凡,莫益俊,戴璐,等.非小細胞肺癌化療療效相關血清小分子蛋白的初步研究[J]. 北方藥學,2012,9(10):52-53.

[12] Yu Z,Yu JK,Fang XF,et al. Proteomic biomarker predicts therapeutical effects of oxaliplatin combining with fluoropyrimidine in metastatic gastric cancer patients by the SELDI-proteinchip platform[J]. Hepatogastroenterology,2013,60(127):1800-1804.

[13] 王佐廣,陶燕鐸,劉雅,等.男性高血壓前期與正常血壓及原發性高血壓患者血漿比較蛋白質組學研究[J].中華心血管病雜志,2010,38(1):5-10.

[14] 張敏,孫琳. 代謝組學在糖尿病中的研究應用[J]. 醫學綜述,2013,19(5):914-916.

[15] 楊必成,朱茂祥,謝劍平. 蛋白質組學技術在吸煙與健康研究中的應用[J]. 中國煙草學報, 2012,18(6):85-92.

[16] 尹小毛,劉志輝,劉玉美,等. 肺結核患者強化治療前后血清差異蛋白質質譜分析[J]. 臨床肺科雜志,2010,15(5):697-698.

[17] 周峰,郭霞,張莉,等. 新疆哈薩克族食管癌患者放化療前后血清蛋白質組學特征差異分析[J]. 癌癥進展,2011, 9(3):325-332.

Identification of differential plasma proteins in lung adnocarcinoma treated with chemotherapy

ZHUJing-hua,WANGXiao-hua,WANGFu-qiang

JiangsuCancerHospital,Nanjing,Jiangsu210009,China

Objective To seek out plasma protein markers for predicting chemotherapy sensitivity of advanced lung adenocarcinoma patients who experienced pemetrexed combined cisplatin by screening plasma different expressed proteome in chemosensitive or resistant patients. Methods 8 patients were included. Plasma from the progression group and the non-progression group were collected before and after chemotherapy and analyzed using a proteomic approach with two-dimensional gel electrophoresis (2DE) and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Results The 2-DE image of the two groups was set. 21 differential protein spots were analyzed by MALDI-TOF-MS, and 19 protein spots were identified, including Pyruvate Kinase M2, Adenylate kinase 5, alpha-2-antiplasmin precursor, fibrinogen gamma, oxysterol binding protein-related protein 3, etc. Conclusion Differential protein in plasma could be used as biomarkers to predict chemotherapy sensitivity.

lung adenocarcinoma; chemotherapy; tumor biomarkers; proteomics

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.04.009

210009 江蘇 南京，江蘇省腫瘤醫院腫瘤內科

2016-07-19]