NSCLC外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化臨床意義

程清萍 柯耀棋

NSCLC外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化臨床意義

程清萍 柯耀棋

目的 研究非小細(xì)胞肺癌(None-small cell lung cancer，NSCLC)患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化的臨床意義。方法 選擇NSCLC患者(NSCLC組)和正常健康人(CON組)為研究對(duì)象，檢測(cè)并比較兩組研究對(duì)象外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化，比較外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化與未甲基化患者R0切除率、3年生存率及總生存時(shí)間的差異。結(jié)果 NSCLC組患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于CON組(P<0.05)。NSCLC組患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化在胸腔積液、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期存在明顯差異(均P<0.05)。NSCLC組患者Runx3基因啟動(dòng)子甲基化者R0切除率、3年生存率及總生存時(shí)間均顯著低于未甲基化者(均P<0.05)。結(jié)論 NSCLC患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化異常，在病情及預(yù)后評(píng)估中具有一定臨床價(jià)值。

NSCLC；Runx3；啟動(dòng)子；甲基化；臨床意義

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)病機(jī)制與基因啟動(dòng)子甲基化異常密切相關(guān)，國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)甲基化異常在NSCLC病情及預(yù)后評(píng)估中具有重要意義，可作為其病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物[1-2]。Runx3基因可調(diào)控TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路而調(diào)控細(xì)胞周期，基因啟動(dòng)子甲基化已被證實(shí)與NSCLC病情及預(yù)后密切相關(guān)，可作為NSCLC病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物，但這些研究多為術(shù)后病理標(biāo)本的檢測(cè)，存在極大的臨床限制[3-4]。本研究檢測(cè)NSCLC患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化，研究其在NSCLC病情及預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2011年1月至2013年1月診治的NSCLC患者為研究對(duì)象(NSCLC組)，均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：① 經(jīng)癥狀體征、腫瘤標(biāo)志物、肺部增強(qiáng)CT和病理組織學(xué)檢查確診；② 原發(fā)腫瘤發(fā)生于單側(cè)肺，既往未行手術(shù)、放療、化療及靶向藥物等治療；③ KPS評(píng)分≥70分，預(yù)計(jì)生存期超過(guò)3個(gè)月；④ 排除既往肺癌復(fù)發(fā)，排除合并其他腫瘤及嚴(yán)重心腦肺疾病。另選擇同期體檢的正常健康人為對(duì)照(CON組)，NSCLC組和CON組研究對(duì)象在性別、年齡、KPS評(píng)分方面的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P>0.05，(見(jiàn)表1)。

表1 NSCLC組和CON組研究對(duì)象一般臨床資料比較

二、Runx3基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)

NSCLC組和CON組研究對(duì)象均空腹8h后取靜脈血，提取基因組gDNA純化，采用甲基化特異性PCR法檢測(cè)兩組研究對(duì)象外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化，引物采用Methyl Primer Express V1.0設(shè)計(jì)，具體序列(見(jiàn)表2)。反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，95℃變性60s，61℃退火45，72℃延伸45s，共32個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72℃延伸8min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后根據(jù)條帶顯示結(jié)果判斷甲基化(M)和未甲基化(U)。

表2 甲基化特異性PCR檢測(cè)Runx3基因啟動(dòng)子甲基化引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。NSCLC患者Runx3基因啟動(dòng)子甲基化率在不同臨床病理因素中差異采用χ2檢驗(yàn)。NSCLC組患者Runx3基因啟動(dòng)子甲基化和未甲基化預(yù)后對(duì)比采用t或χ2檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Runx3基因啟動(dòng)子甲基化比較

NSCLC組外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化50例，甲基化率為71.4%，CON組正常健康人Runx3基因啟動(dòng)子甲基化1例，甲基化率為2.0%，NSCLC組患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于CON組正常健康人(P<0.05)。

二、Runx3基因啟動(dòng)子甲基化與臨床病理關(guān)系

NSCLC組外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化在性別、年齡、吸煙史和病理類型方面無(wú)明顯差異(均P>0.05)，在胸腔積液、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，有胸腔積液、低分化、腫瘤最大徑≥7cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Ⅲ+Ⅳ期患者Runx3基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于無(wú)胸腔積液、高+中分化、腫瘤最大徑<7cm、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Ⅰ+Ⅱ期患者，均P<0.05。(見(jiàn)表3)。

表3 NSCLC組患者Runx3基因啟動(dòng)子甲基化與臨床病理因素關(guān)系

三、Runx3基因啟動(dòng)子甲基化與預(yù)后關(guān)系

NSCLC組患者中Runx3基因啟動(dòng)子甲基化者R0切除率、3年生存率及總生存時(shí)間均顯著低于Runx3基因啟動(dòng)子未甲基化患者，均P<0.05，(見(jiàn)表4)。

表4 NSCLC組患者Runx3基因啟動(dòng)子甲基化與未甲基化預(yù)后比較

討 論

甲基化與基因突變機(jī)制完全不同，不涉及堿基序列的突變而僅甲基基團(tuán)改變，5’甲基化mCpG結(jié)構(gòu)自身或結(jié)合甲基結(jié)合蛋白后可阻止轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合而抑制RNA轉(zhuǎn)錄，高甲基化和低甲基化異常均可導(dǎo)致基因表達(dá)異常，是目前發(fā)現(xiàn)的最主要的基因轉(zhuǎn)錄前調(diào)控機(jī)制[5]。Runx3基因?yàn)樾掳l(fā)現(xiàn)的抑癌基因，主要功能為調(diào)控TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路，具有調(diào)控細(xì)胞周期、增殖及凋亡作用，在多種腫瘤中已被證實(shí)處于高甲基化狀態(tài)[6]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[7]。越來(lái)越多的研究證實(shí)Runx3基因啟動(dòng)子甲基化在腫瘤的病情和預(yù)后評(píng)估中具有重要作用，較傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物具有更高的靈敏度及特異性，相信隨著大規(guī)模基因測(cè)序及高通量檢測(cè)基因水平的標(biāo)志物更符合精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的要求[8]。目前的研究證實(shí)，NSCLC切除后的腫瘤標(biāo)本中可檢測(cè)到Runx3基因啟動(dòng)子mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Runx3基因啟動(dòng)子甲基化是其表達(dá)下降的主要機(jī)制，且與NSCLC病情嚴(yán)重程度及TNM分期緊密相關(guān)[9]。本研究中，NSCLC組患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化顯著高于CON組正常健康人(P<0.05)，這些證據(jù)證實(shí)Runx3基因啟動(dòng)子甲基化異常與NSCLC發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性，可能是是NSCLC病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物。

目前研究Runx3基因啟動(dòng)子與NSCLC病情及預(yù)后的關(guān)系主要為術(shù)后病理標(biāo)本的檢測(cè)，無(wú)法在術(shù)前為病情及預(yù)后評(píng)估提供客觀證據(jù)，對(duì)于某些無(wú)法取得病理組織的患者不具有任何價(jià)值，這些不足限制了術(shù)后標(biāo)本檢測(cè)在臨床上的廣應(yīng)用[10-11]。與手術(shù)后切除標(biāo)本相比，外周血具有獲取方便等優(yōu)點(diǎn)，尤其對(duì)于某些無(wú)法取得病理的患者更具有優(yōu)勢(shì)，但外周血可能存在陽(yáng)性率不高的缺點(diǎn)。本研究中，NSCLC組患者外周血Runx3基因啟動(dòng)子甲基化在性別、年齡、吸煙史和病理類型方面無(wú)明顯差異(均P>0.05)，在胸腔積液、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，有胸腔積液、低分化、腫瘤最大徑≥7cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Ⅲ+Ⅳ期患者Runx3基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于無(wú)胸腔積液、高+中分化、腫瘤最大徑<7cm、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和Ⅰ+Ⅱ期患者(均P<0.05)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組患者中Runx3基因啟動(dòng)子甲基化者R0切除率、3年生存率及總生存時(shí)間均顯著低于Runx3基因啟動(dòng)子未甲基化患者(均P<0.05)。這些證據(jù)表明Runx3基因啟動(dòng)子高甲基化在NSCLC病情及預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值，與傳統(tǒng)的標(biāo)志物相比，外周血樣本獲取方便快捷，基因水平的標(biāo)志物可能具有更高的特異性及靈敏度，相信隨著科技水平的發(fā)展，基因水平的標(biāo)志物更具有優(yōu)勢(shì)。

[1] 胡凱,宋劍非,杜振宗,等.DNA甲基化與肺癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué),2013,34(17):2737-2739.

[2] 邱小明,喬艷潔,劉斌,等.DNA甲基化在肺癌早期診斷中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)肺癌雜志,2012,15(4):234-241.

[3] 肖述兵,彭碧華,萬(wàn)金龍,等.原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌組織RUNX3基因啟動(dòng)子表達(dá)及臨床意義[J].浙江臨床醫(yī)學(xué),2012,14(7):775-776,782.

[4] 唐艷,吳芳,胡春宏,等.RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化與早期非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2011,36(7):650-654.

[5] 楊明昊,謝莎,謝小薰,等.膠質(zhì)瘤CpG島甲基化表型的研究進(jìn)展[J].中華神經(jīng)外科雜志,2015,31(5):530-532.

[6] 王曉江,鄭雄偉,林賢東,等.不同乳腺病變中Runx3啟動(dòng)子甲基化的差異[J].中華病理學(xué)雜志,2014,43(7):447-450.

[7] 石明偉,張俠,許春偉,等.結(jié)直腸癌和管狀腺瘤中Runx3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的分析[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2013,29(12):1283-1287.

[8] 吳丹,董瑩,張矛,等.RUNX3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肝癌臨床病理特征的Meta分析[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2014,19(8):705-710.

[9] 王培培,張翠英.內(nèi)蒙古地區(qū)RASSF 1 A、P16、DAPK、RUNX3基因啟動(dòng)子甲基化在非小細(xì)胞肺癌中的研究[J].內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,38(2):98-102.

[10] 楊宗達(dá).FHIT、RUNX3甲基化與肺癌診斷相關(guān)性研究[D].大連醫(yī)科大學(xué),2014.

[11] 趙培革,魯?shù)芦\,姬曉青,等.非小細(xì)胞肺癌血清MGMT、RASSF2、RUNX3及RASSF1A基因啟動(dòng)子CpG島甲基化的聯(lián)合檢測(cè)及意義[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué),2013,3(6):20-23,47.

Detection of peripheral blood Runx3 gene promoter methylation in non-small cell lung cancer and its clinical value

CHENQing-ping,KEYao-qi

DepartmentofRespiratoryMedicine,XiangyangCentralHospital,Xiangyang,Hubei441000,China

Objective To detect the peripheral blood Runx3 gene promoter methylation in non-small cell lung cancer and its clinical value. Methods Methylation specific PCR was used to detect the Runx3 gene promoter methylation by peripheral blood in patient with non-small cell lung cancer (the NSCLC group) and normal healthy people (the control group). The Runx3 gene promoter methylation rates in different clinicopathological factors were compared. The R0 radical resection, 3-year survival rate and total survival time between patients with Runx3 gene promoter methylation and unmethylation were compared. Results The Runx3 gene promoter methylation rate in the NSCLC group was significantly higher than in the control group (P<0.05). The Runx3 gene Promoter methylation rate showed obvious difference in pleural effusion, degree of differentiation, tumor diameter, lymph node metastasis, distant metastasis and TNM staging were significant different (allP<0.05), but no difference in sex, gender, age and pathological types (allP>0.05). The R0 radical resection, 3-year survival rate and total survival time in patients with Runx3 gene promoter methylation were significantly lower than in patients with Runx3 gene promoter unmethylation (allP<0.05). Conclusion Runx3 gene promoter’s hypermethylation has value in the evaluation of non-small cell lung cancer’s disease condition and prognosis, which can be used as a bio-marker.

non-small cell lung cancer; Runx3; promoter; methylation; clinical value

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.04.008

441000 湖北 襄陽(yáng)，襄陽(yáng)市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科

柯耀棋，zumorf@126.com

2016-08-18]